К середине XV века военно-политическая ситуация меняется, и соотношение сил в Восточном Средиземноморье становится не в пользу госпитальеров. Взятие Константинополя в 1453 году победоносными войсками султана Мехмета II прозвучало для ордена сигналом смертельной опасности. Мехмет II был искусным полководцем, образованным человеком, знал несколько языков, и завоевание Родоса было для него лишь вопросом времени. Над госпитальерами нависла смертельная угроза.

И вот к крепости госпитальеров подошло семидесятитысячное войско султана. Великим магистром ордена был тогда Пьер д’Обюссон. Мощи турецкой армии он мог противопоставить только 600 рыцарей, включая оруженосцев, и от 1,5 до 2 тыс. человек наемных иностранных войск. На стороне рыцарей сражалось и местное население, которому раздали оружие. Количество рабов, также участвовавших в военных действиях, в те времена никто не учитывал.

Безусловно, силы никак нельзя назвать равными. В конце концов огромное численное превосходство турок и мощь их артиллерии начали сказываться на ходе осады. Южные стены города, окружавшие так называемый еврейский квартал, были практически разрушены. Защитники Родоса оказались на грани поражения. Когда 27 июля башибузуки — передовой отряд турецкого войска — пошли в атаку, казалось, что ничто уже не может спасти осажденных. Немногочисленные оставшиеся в строю рыцари отчаянно сражались в проемах полуразрушенных стен. Д’Обюссон лично возглавил оборонявшихся на самом опасном направлении. В жестокой схватке он был четырежды ранен, но продолжал сражаться, пока не упал, пронзенный копьем янычара.

И все-таки победило мужество госпитальеров. Башибузуки, увидев столь отчаянное сопротивление, в панике откатились назад, сминая подходившее подкрепление. Началась невообразимая свалка, в которой турки потеряли не менее 5 тыс. человек. Опасаясь полного разгрома, главнокомандующий турецкими войсками Мисак-паша был вынужден дать сигнал к отступлению. На следующее утро турки погрузились на ожидавшие их суда и отбыли восвояси. По дороге Мисак-паша умер от дизентерии.

И не мужество ли вкупе с искусством орденских хирургов спасло великого магистра? Он выжил. Когда весть о победе ордена достигла королевских домов Европы, на Родос хлынул поток финансовой и военной помощи. Пьер д’Обюссон немедленно развернул широкие работы по восстановлению разрушенных фортификаций Родоса. Он понимал, что рано или поздно ордену предстоит сойтись в решающей схватке с турками.

Смерть Мехмета II привела к власти его сына Баязида, который намеревался осуществить множество походов на различных направлениях против Европы, но из-за его ленивого и бездеятельного характера успеха в войне с Европой не последовало.

Гораздо серьезнее был настроен сын Баязида Селим. Воцарившись и поколебав могущество мамлюков, Селим овладел Палестиной, на стенах Иерусалима было водружено знамя с полумесяцем. Победитель Персии, властелин Египта, Селим готовился направить все свои силы против христиан. Когда в Европе стало известно, что Иерусалим оказался во власти турок, духовенство и рыцари восприняли это как иго неверных, под которое попала Святая земля, так что для возрождения духа старинных крестовых походов оставалось совсем немного.

Однако Старый Свет был уже не тот. Крестовый поход все-таки был провозглашен, и сделал это на Пятом Латеранском соборе папа Лев Х. Он даже выслал легатов во все европейские страны, способные дать отпор, и объявил о необходимости перемирия между всеми европейскими государствами на 5 лет. Тех государей, кто не соблюдал перемирия, папа грозил отлучить от церкви. Европейские монархи не сопротивлялись жесткому поведению папы, они ответили ему согласием. По всей Европе усиленно собирались налоги, пожертвования, совершались духовные процессии. Наконец был составлен план войны. Но все эти приготовления оказались напрасными: мир между христианскими монархами в скором времени был нарушен, и каждый употребил те армии, которые были направлены против турок, на свои цели. Соперничество Карла V и Франциска I перенесло войну в Европу, и все перестали думать о походе. Крестовый поход Льва Х лишь возбудил воинственный фанатизм турок против христиан. Преемник Селима Сулейман овладел Белградом и снова направил силы османов на Родос.

И этот фанатизм не замедлил проявиться. В июне 1522 года двухсотысячное турецкое войско на 700 кораблях направилось к берегам Родоса. Султан лично возглавил огромную армию, которая должна была покончить с возмутителями спокойствия Османской империи. Рыцари просто не могли выдержать такую осаду и обратились за помощью к государствам Европы. Помощи не последовало. Им оставалось только противопоставить врагу свое немногочисленное войско и храбрость. Шесть месяцев они героически удерживали остров, осажденный полчищами войск Османской империи! Рыцари проявляли чудеса героизма, но армия Сулеймана Великолепного была слишком многочисленна. Стремясь избежать поголовного истребления рыцарей, великий магистр Филипп Вилье де Лиль-Адан решил вступить в переговоры с султаном, предложившим госпитальерам заключить мир на почетных условиях. Первого января 1523 года госпитальеры навсегда покинули Родос, который они удерживали более 200 лет, отражая различные натиски и ведя активную борьбу с пиратами и турками.

Так закончилась славная история отважных защитников христианских ценностей. Рыцари были выбиты с острова и стали искать убежища в Италии. Слезы лились из глаз папы и епископов, когда рыцари рассказывали о своих бедствиях на Родосе. Но сострадания пастырей христианской церкви было недостаточно, чтобы предоставить рыцарям то, что они просили у европейских государей: уголок земли, пустынный остров в Средиземном море, где члены ордена могли бы продолжать бороться с турками.

Отступать зачастую труднее, чем атаковать. Путь рыцарей ордена от Родоса к берегам Европы был долог и труден. Их флот насчитывал 50 судов всех форм и размеров, включая 17 транспортных, арендованных у родосцев. На борту находилось около 5 тыс. человек, включая больных и раненых. На острове Кандия госпитальерам был устроен торжественный прием, однако рыцари вели себя сдержанно. Они помнили, что венецианцы, владевшие островом, отказались помочь им во время осады Родоса. Два месяца длился ремонт судов. Лишь в марте 1523 года госпитальеры продолжили путь. Через два месяца они были в Мессине. Однако и здесь рыцарей ждала неудача. На побережье южной Италии свирепствовала чума. Шесть месяцев госпитальеры, спасаясь от эпидемии, переезжали из Неаполя в Виттербо, из Виттербо в Вила Франка, пока наконец не обосновались в Ницце, находившейся в то время во владениях герцога Савойского.

Конечно же, слава о храбрых защитниках цитадели на Родосе облетела всю Европу. Европейские монархи отдавали должное мужеству, проявленному госпитальерами при обороне Родоса. Однако прийти на помощь странствующим рыцарям никто не спешил. Трудно сказать, как дальше сложилась бы судьба ордена, если бы не выдающийся дипломатический талант великого магистра Филиппа де Лиль-Адана. Вице-король Сицилии дал понять великому магистру, что орден мог бы рассчитывать на его покровительство, если бы согласился избрать в качестве места своего пребывания Триполи — новое владение испанской короны в Северной Африке. Захват Триполи, по словам вице-короля, в Мадриде рассматривали в качестве первого шага на пути завоевания Египта.