прием используют для стерилизации, как питательных сред, так и посуды.

Стерилизация посуды.

Большинство культур в лабораторных условиях выращивают в пробирках, колбах Эрленмейера различного объема и чашках Петри одно- или многоразового использования. Вначале посуду тщательно моют с использованием детергентов, а также раствора двухромовокислого калия в серной кислоте (хромпика[80]). Вымытую посуду ополаскивают водопроводной, затем дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу. Чтобы избежать заражения стерильных предметов из воздуха, перед стерилизацией их закрывают ватными пробками, заворачивают в оберточную бумагу или закрывают фольгой (у стаканов, колб достаточно завернуть только горлышко). Затем посуду можно стерилизовать двумя способами:

1. Посуду выдерживают в автоклаве под давлением в течение 20–40 минут при температуре 100–130 °C. Продолжительность автоклавирования зависит от его режима: при давлении 0.5 атмосферы — 20–40 минут, при 1 атм. — 15 минут.

2. При сухом способе стерилизации чашки Петри, колбы, стаканы, завернутые в плотную бумагу, стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 140 °C в течение 2 часов, при температуре 180 °C — 30 минут. При более высоких температурах ватные пробки буреют, а бумага становится ломкой.

Стерилизация инструментов.

Инструменты (скальпели, пинцеты, иглы и т. д.) стерилизуют в сушильном шкафу способом № 2. Шприцы, ножницы, пробочные сверла удобнее кипятить. Металлические предметы нельзя автоклавировать: под воздействием пара они ржавеют и тупятся. Непосредственно перед работой и в процессе её инструменты помещают в стакан со спиртом и обжигают в пламени спиртовки. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции! Перед повторным употреблением его снова окунают в спирт и обжигают.

Стерилизация материалов.

Вату, марлю, ватные пробки, фильтровальную бумагу, халаты, косынки стерилизуют в автоклаве под давлением 2 атм. в течение 25–30 мин.

Стерилизация питательных сред.

Автоклавирование питательных сред для выращивания культур тканей проводят после их разлива в пробирки или колбы под давлением 0.7–0.8 атм. при температуре 115–120 °C в течение 15–30 минут, в зависимости от объема среды. Если в результате стерилизации среда помутнела, следовательно, неправильно выбран режим стерилизации[81].

Холодная стерилизация.

Органические жидкости, не выносящие нагревания, освобождаются от бактерий при пропускании через стерильные мелкопористые бактериальные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм.

Как изготовить микробиологическую пробку

Для предотвращения заражения культур из воздуха и их преждевременного высыхания пробирки и колбы закрывают пробками. Пробки для посуды условно можно разделить на ватные (традиционные микробиологические) и крышечки из фольги.

С ватными пробками проще работать начинающим — меньше риска получить ожог. Пробки должны плотно входить в пробирку (колбу) на 2–3 см, или на 2/3 своей длины; при открывании хорошо закрытой посуды раздается характерный хлопок.

Недостатки микробиологических пробок — довольно трудоемки в изготовлении, часто прожигаются, не очень удобны при долговременном культивировании. Если для микробиологических культур сроки культивирования редко превышают 2 недели, то для растительных клеток продолжительность субкультивирования — как минимум 3 недели. За это время среда начинает подсыхать. Поэтому в таких случаях важно закрывать ватную пробку сверху герметично парафильмом или пищевой пленкой.

Крышечка из фольги проще в работе — легко изготавливается (вырезается кружочек или квадратик по диаметру горлышка пробирки или колбы + один — полтора сантиметра для отгибания вниз).

Фольгу нужно брать плотную. Если нет плотной — тонкая фольга складывается в 3–4 раза. При обжигании краешков такой пробки нужно быть аккуратным, чтобы не получить ожог, так как фольга металлическая и хорошо проводит тепло. После одевания пробки самый краешек, загнутый вниз на пробирку или колбу, оборачивается узенькой полоской парафильма или пищевой пленки в 2–3 оборота, таким образом краешки плотно прилегают к посуде, и крышка держится надежнее, герметичнее закрывает, снижается риск контаминации (занесения посторонней микрофлоры)

Изготовление микробиологической пробки

Сложить вдвое кусок марли, накрыть им верхнюю часть пробирки. На середину куска, закрывающего отверстие пробирки, положить вату, протолкнуть в пробирку на глубину примерно 3–4 см. Вату очень плотно утрамбовать, затем концы марли скрутить в центре, обвязать ниткой, лишнее обрезать. Обрезки марли можно использовать вместе с ватой при изготовлении пробок. Проверить качество пробок: хлопок в момент открывания пробирки, очень твердая ("каменная") на ощупь.

Для колб пробки готовят следующим образом: прямоугольный слой ваты скатать в виде очень плотного, до твердости валика нужных размеров, учитывая диаметр и длину горла колбы, обернуть его двойным марлевым слоем.

Не использовать пробки, изготовленные только из ваты — они легко воспламеняются при обжигании!

Работа в ламинарном боксе

Все операции, связанные с разливом питательных сред, пересадкой каллусов, тканей, микроорганизмов, ведут в специальных комнатах или ламинарных боксах, где обеспечиваются стерильные условия работы. Ламинарный бокс (ламинар) приспособление для работы в стерильных условиях. Асептические условия в ламинаре создаются с помощью тока воздуха. Ламинарное движение воздуха — движение, при котором струйки воздуха двигаются параллельно, обтекая препятствие равномерными слоями. Ток воздуха, проходя через ламинар, движется к исследователю[82], что позволяет освобождать внутреннее пространство ламинара от спор микроорганизмов.

Подготовка бокса к работе

В специальных комнатах (микробиологических боксах) проводят влажную уборку с дезинфицирующими агентами. Для надежности стерилизации перед началом работы помещение лаборатории и внутреннее пространство ламинара облучают УФ-лучами. Облучение ультрафиолетовыми лучами (260 нанометров) — наиболее часто используется в лабораториях для стерилизации помещений, настольных боксов. При длительном воздействии эти лучи вызывают гибель всех бактерий. Бактерии погибают очень быстро, а споры грибов значительно медленнее. Поэтому в боксах устанавливают бактерицидные лампы БУФ-15 или БУФ-30, которые включаются на 30 минут за 1 час до работы. Кроме того, рекомендуется проводить профилактическое облучение боксов в течение 2 часов.

Непосредственно перед работой необходимо протереть настольный бокс или внутренние поверхности ламинара этиловым спиртом[83], разложить в нем необходимые инструменты и материалы: спирт в закрытой посуде, спиртовку (горелку), спички, простерилизованный инструмент и посуду.

Рабочее место при отсутствии ламинара

Наличие ламинара — это отлично, просто замечательно. Но что делать, если его нет? Или появится в обозримо-необозримом будущем, а культуры клеток заводить нужно уже сейчас?

Шаг первый — постарайтесь найти малопосещаемое людскими массами помещение — чем меньше посетителей — тем меньше источников загрязнения.

Шаг второй — всегда перед работой проводите влажную уборку всей комнаты и стерилизуйте ее кварцевой (ультрафиолетовой) лампой.

А теперь, собственно — о рабочем месте. В нашем случае оно выглядело примерно так: стол, покрытый ламинатом. Лучше — железный, но сойдет и покрашенный масляной краской. В идеале — поверхность стола должна быть негорючей. Именно поэтому железный стол — лучше всего. Ламинат тоже загорается не сразу, хуже всего