множества заряженных частиц. В качестве примера показано разделение четырех фосфониевых ионов. Если записать общий ионный ток, то получим только два пика. Селективное детектирование отдельных соединений возможно при определенном соотношении масса/заряд (правая часть рис. 30).

Рис. 30. МС-детектирование при КЭ:

а) универсальное детектирование при регистрации полного ионного тока; б) Активное детектирование при регистрации отдельных соотношений массы к заряду.

Рассматривались также другие методы детектирования (спектроскопия комбинационного рассеяния, измерение радиоактивности в режиме реального времени, круговой дихроизм, коэффициенты преломления света, капиллярная вибрация). Их возможности для рутинного использования в настоящее время еще не определены.

Само собой разумеется, что могут использоваться УФ-неактивные и нефлуоресцирующие пробы, если применять реагенты, употребляемые обычно для получения соответствующих производных перед разделением хромофоров и флуорофоров. В результате этого, однако проявляют себя недостатки предколоночного происхождения, известные из ВЭЖХ. Специальные реагенты для электрофореза, имеющие помимо хромофора еще и соответствующий заряд, являются темой для обсуждения.

При детектировании на основе лазерной флуоресценции для определения с помощью возбуждения на длине волны около 380 нм в большинстве случаев пробу перед разделением необходимо подвергнуть воздействию флуоресцентной метки. В качестве примера назовем разделение 3-(4-карбоксибензоил)-2-хинолин-карбоксиальдегид (КБХКА) — производных аминокислот.

Описаны первые экспериментальные разработки для получения производных после прохождения колонки, однако они пока еще не пригодны для использования вне стен исследовательских лабораторий.

В таблице 12 представлены достижимые границы обнаружения наиболее часто встречающихся систем детектирования. Из таблицы видно, что благодаря небольшому объему может достигаться высокая чувствительность по массе. Концентрационная чувствительность находится в пределах ВЭЖХ.

6.6. Количественный анализ

На воспроизводимость получаемых результатов влияет множество факторов: разница в электропроводности между разделительным электролитом и раствором пробы, большое различие в концентрации компонентов пробы и их электрофоретическая подвижность, различие в составе пробы. С другой стороны, преимущества КЭ проявляются тогда, когда необходимо проанализировать очень малые объемы проб; например, при 5 анализе ионов в дождевых каплях или в биологических пробах.

Рис. 31. Некоторые часто используемые реакции получения производных.

Миниатюризация ввода пробы в коммерческих приборах, между тем, прогрессирует так сильно, что из общего объема пробы 3 мкл в автоматизированных приборах можно сделать множество вводов. При этом, однако, не исключено, что состав пробы во время ввода изменится. Причина заключается в занесении буфера в пробу или в селективном вводе определенных компонентов пробы при электрокинетическом вводе. Работа со столь малыми объемами затруднена, если объем пробы в автозагрузчике может изменяться за счет испарения. Эти эффекты можно уменьшить при помощи охлаждения пробы или использования герметичного затвора в сосуде для пробы. Если необработанные данные анализа представлены в форме хроматограмм или фореграмм, то количественные результаты анализа получают или определением высоты пиков, или после интегрирования в виде площади пиков. Только в области определения примесей количественное выражение их концентрации через высоту более надежно, чем через площадь пика. Этому есть две причины: первая заключается в том, что при анализе примесей высота пика пропорциональна их концентрации, так как эффекты насыщения и перегрузки можно исключить, а вторая заключается в том, что ошибка автоматизированного определения высоты в этом случае меньше, чем при интегрировании пиков. Как только высота пиков возрастает, интегрирование становится рациональным и необходимым.

Это будет показано на примере калибровочной кривой натрия при определении ионов металла с применением непрямого УФ-детектирования. В то время, как линейная область при использовании высоты пика для количественного определения очень мала, и кривая уже при 4 ppm выходит в область насыщения, при представлении зависимости площади пика от концентрации корреляционная зависимость линейна. Причиной нелинейности калибровочной кривой с высотами пиков является, кроме всего прочего, треугольная форма пиков. Как можно показать теоретически, только при гауссовой форме пиков концентрация пропорциональна как площади пика, так и его высоте. При других формах пика интегрирование обязательно для того, чтобы получить линейную калибровочную кривую.

Рис. 32 показывает полученную калибровочную кривую в области концентраций от 1 до 10 ppm.

Рис. 32. Калибровочные кривые, построенные по высоте пика (А) и плотили пика (В).

Условия: прибор для КЭ — Millipore Waters Quanta 4000; капилляр — 75 мкм, 50/56 см; поле — 446 В/см; буфер: S мМ имидазол/серная кислота, pH 5.3; ввод пробы гидростатический, 30 с, детектирование непрямое. 214 им; проба — калий, натрий, барии, кальций, магний и литии с концентрациями 4, 6, 8 и 10 ррт.

При КЭ, в отличие от ВЭЖХ, пробы перемещаются мимо детектора не с одинаковыми скоростями. По этой причине компоненты пробы с одинаковыми молярными коэффициентами экстинкции при одинаковом вводимом количестве проявляются в виде пиков различной площади.

В простейшем случае УФ-детектора это можно легко показать, если рассчитать время, за которое движущиеся объекты с различными скоростями проходят область УФ-детектирования.

Аналогичные явления встречаются при каждом разделении в КЭ. Компоненты пробы, которые первыми движутся мимо детектора, обладают высокой скоростью, поэтому ширина их пиков на самописце меньше. Табл. 13 показывает зависимость изменения ширины пика (в сив мм при записи на самописце) стандартного прямоугольного пика шириной 0.5 см. Если бы в КЭ отсутствовало уширение полос, то первые пики были бы самыми узкими, так как они перемещаются мимо детектора быстрее других.

Если привести полученные площади пиков к времени миграции, то получим сигнал пробы, независящий от скорости перемещения. С помощью такого нормирования удается в некоторых случаях сгладить колебания времени миграции.

Колебания ЭОП являются тем фактором, который через скорость миграции непосредственно влияет на площадь пика. На рис. 33 для некоторых тестовых соединений представлены времена миграции, соответствующие первым 27 вводам пробы.

Рис. 33. Воспроизводимость времени миграции.

После первых 4 вводов (нестационарный период) достигается первое постоянное значение, при котором время миграции колеблется весьма слабо. После 9 вводов пробы капилляр был помещен на 48 часов в разделительный буфер и после этого использовался вновь. При этом уже после короткой переходной фазы появляется большой ЭОП. Это плато остается постоянным при последующих 20 вводах.

Эти эксперименты ясно показывают, что после короткого времени установления равновесия могут быть получены воспроизводимые условия анализа. При замене буфера необходимо, однако, менять и капилляры или, по крайней мере, промывать их новым буфером от 10 до 15 минут. Так как ЭОП существенно более эффективно изменяет слой буфера на внутренней поверхности капилляра,