в биохимии и молекулярной биологии. Хроматографические методы используются для решения следующих задач:

• разделение сложных смесей неорганических и органических веществ;

• выделение индивидуальных веществ (белков, углеводов, витаминов, ферментов, липидов, аминокислот, органических кислот, антибиотиков и др.) из сложных смесей;

• очистка индивидуальных веществ от примесей;

• концентрирование веществ из сильно разбавленных растворов, и др.

Хроматография основана на распределении компонентов смесей веществ между двумя несмешивающимися фазами — неподвижной и подвижной. В качестве неподвижной фазы используют твердое вещество или жидкость, нанесенную на твердый инертный носитель. Подвижной фазой служит газ или жидкость, которые содержат смесь разделяемых веществ. В зависимости от природы содержащей вещество фазы различают газовую (ГХ) и жидкостную (ЖХ) хроматографии. Различие в природе носителя удваивает каждый класс — в результате получаем 4 основных типа хроматографии — газовую твердофазную (ГТХ) и газовую жидкостную (ГЖХ), а также жидкостную твердофазную (ЖТХ) и жидкость-жидкостную (ЖЖХ). Другое название ЖТХ — препаративная колоночная хроматография.

Хроматографическое разделение основано на том, что отдельные компоненты смеси перемещаются по колонке с различной скоростью и достигают выхода через разные промежутки времени.

Растворитель (или газ), проходящий через колонку, называют элюентом, процесс перемещения вещества вместе с элюентом — элюированием. Разработаны методы обнаружения и количественного определения разделяемых соединений, которые не обязательно должны быть окрашены. В современной колоночной хроматографии твердую фазу, как правило, не извлекают из колонки, а элюирование проводят до тех пор, пока отдельные вещества не выйдут одно за другим из колонки. Каждый компонент регистрируют непосредственно на выходе из колонки с помощью разнообразных методов (фотометрических, потенциометрических, рефрактометрических и др.) или же фракции компонентов смеси собирают коллектором, затем в отобранных фракциях элюата определяют количество исследуемого вещества, выбирая метод, пригодный для этой цели. Препаративная колоночная хроматография является одним из самых эффективных методов выделения органических веществ и разделения их смесей, однако соответствующие эксперименты требуют длительного времени, осуществление их в органическом практикуме проблематично и в настоящем пособии рассмотрено не будет.

Следует остановиться на лишь на двух хроматографических методах, могущих найти применение в органическом практикуме. Это — аналитическая газо-жидкостная хроматография (ГЖХ) и тонкослойная хроматография (ТСХ). Оба метода находят используются для контроля за протеканием реакций и определения степени чистоты синтезированных соединений.

Газо-жидкостная хроматография

Разделение летучих смесей в газовой хроматографии проводят в специальных приборах — хроматографах. Выбор газа-носителя зависит от типа детектора. Скорость потока газа устанавливают постоянной. Разделяемую смесь вводят в колонку с помощью дозирующего устройства (обычно микрошприца). Ее количество обычно невелико и составляет 1 мкл -0.1 % раствора (порядка 1 мкг вещества). В системе ввода поддерживают такую температуру, которая обеспечивает испарение образца, затем вместе с газом-носителем введенный газообразный образец попадает в колонку, где происходит разделение компонентов. Эта колонка заполнена твердым носителем, на который нанесен тонкий слой нелетучей органической жидкости. Эта жидкость и служит неподвижной фазой.

Разделение компонентов осуществляется при прохождении через колонку парообразного образца вместе с газом-носителем. Компоненты распределяются между движущимся газом-носителем и неподвижной фазой и перемещаются по колонке с различными скоростями, которые зависят от природы разделяемых компонентов, природы неподвижной фазы и температуры колонки. После этого отдельные компоненты разделяемой смеси в порядке их расположения в колонке поступают в детектор. Сигнал детектора зависит от концентрации компонента, находящегося в выходящем из колонки потоке газа-носителя..

Запись сигнала детектора как функция времени или объема газа-носителя представляет собой кривую элюирования — хроматограмму. Хроматограмма включает нулевую линию, соответствующую протеканию через детектор чистого газа-носителя, и ряд пиков, отвечающих прохождению через детектор совместно с газом-носителем компонентов анализируемой смеси. Хроматограмма характеризуется временем удерживания τ (время, необходимое для элюирования вещества до его максимальной концентрации) и объемом удерживания или удерживаемым объемом Vr (объем газа, необходимый для извлечения из хроматографической колонки максимального количества вещества).

Качественный анализ хроматограмм основан на идентификации отдельных пиков. Компоненты идентифицируют по времени удерживания, широко используют метод внутреннего стандарта (эталонные растворы), проводят измерения физико-химических свойств компонентов, выходящих из колонки и т. д. Количественный анализ основан на том, что при постоянстве температуры колонки, скорости потока газа и выполнении ряда других условий площадь каждого хроматографического пика или его высота пропорциональны концентрации соответствующего компонента образца.

Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография относится к типу так называемой распределительной хроматографии, разделение веществ в которой обусловлено их различными коэффициентами распределения между двумя несмешивающимися жидкими фазами.

Для получения хроматограмм используют специальные готовые пластинки, покрытые тонким слоем сорбента (силикагель, Аl2О3). Первая фаза — органический растворитель; вторая — адсорбированная на поверхности сорбента вода. Вещество наносят в виде раствора на стартовую линию, после чего пластинку подсушивают и помещают в вертикальном положении в камеру, на дно которой налито немного элюента. Из-за действия капиллярных сил растворитель подниматься по пластине, пока не достигнет верхнего края. Необходимо, чтобы пластина находилась в атмосфере, насыщенной парами растворителя, поэтому камеру закрывают крышкой. По окончании движения растворителя хроматограмму вынимают из камеры, высушивают и выявляют пятна разделенных веществ различными методами.

Для получения четких хроматограмм необходимо, чтобы адсорбция разделяемых компонентов на носителе являлась слабой.

Подвижный растворитель подбирают в зависимости от природы разделяемых веществ и носителя. Как правило, для разделения более полярных соединений используют более полярные растворители. Часто применяют смеси растворителей, например гексан-дихлорметан, бензол-этилацетат и т. п.

Основной количественной характеристикой вещества в тонкослойной хроматографии является величина Rf, равная отношению расстояния, пройденного веществом, к расстоянию, пройденному растворителем (рис. 23).

Рисунок 23. Тонкослойная хроматограмма.

Обычно для расчета Rf расстояния измеряют от стартовой линии до центра пятна:

Rf = Ri/Rs

При постоянстве условий эксперимента коэффициент Rf определяется в основном природой вещества, параметрами сорбента и свойствами растворителей.

Для идентификации и количественного определения веществ хроматограмму после разделения, если компоненты не окрашены, обрабатывают специально подобранным реагентом, образующим с разделяемыми веществами окрашенные соединения — компоненты проявляются в виде пятен. Очень часто применяют пластинки, покрытые слоем сорбента, содержащего люминофор. Так как многие органические соединения поглощают в ультрафиолетовой области, то при рассматривании такой пластинки в УФ-свете эти вещества будут проявляться в виде темных пятен на светящемся фоне. Количество вещества в каждом пятне определяют визуально по интенсивности окраски по сравнению с эталоном, по площади пятна, для люминесцирующих веществ по интенсивности люминесценции, методом отражательной спектрофотометрии, измеряя интенсивность света, отраженного окрашенным пятном (денситометрия) и др.

4.7.Определение температуры плавления.

Для контроля за степенью чистоты твердых органических соединений часто используют измерение температуры его плавления. Чистые вещества обычно обладают четко выраженной температурой плавления, примеси обычно понижают эту температуру или увеличивают интервал, в котором плавится данное соединение. Для известных соединений