class="p1">3. Проростки промыть стерильной дистиллированной водой и поместить в стерильные чашки Петри.

4. В условиях ламинар-бокса под микроскопом вычленить апикальные меристемы и поместить на среды без фермента (контроль) и с ферментом (опыт).

5. Пробирки с меристемами перенести в культуральную комнату.

6. Результаты зарисовать через 2-4-6 недель, сделать выводы.

ТЕМА III. ДЕДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ И КАЛЛУСОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ.

Работа 1. ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСОВ ИЗ ЛИСТЬЕВ ТАБАКА.

Объяснение. Каллусная клетка, в результате деления которою возникает кал лус, представляет собой один из типов клеточной дифференцировки. Для растения in vivo каллус — это группа клеток, возникающая при травмах и защищающая место поранения (раневая паренхима). В ней накапливаются питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа.

Дифференцированные клетки объединяются в растении в ткани и выполняют оп ределенные функции. Клетки различаются не только функционально, но и морфологически.

На питательных средах с большим содержанием ауксинов (2,4 Д) клетки экспланта дедифференцируются и переходят к пролиферации. Особенности дедифференциации клеток экспланта зависят от генетики и эпигенетики экспланта. Клетки утрачивают прежние функции и морфологию. Причем, чем меньше структурно и химически дифференцирована клетка, тем легче получить каллус.

В клетке, готовящейся к делению, стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ДНК, исчезают специфические тканевые белки-антигены, синтезируются новые, специфичные для каллусных клеток. Меняется активность структурных генов и белкового аппарата клеток. Дедифференциация специализированных клеток начинается с обогащения их элементами цитоплазмы: микротрубочками, мембранами ЭПС и комплекса Гольджи, рибосомами, исчезают хлоро- и хромопласты, продукты их деятельности; может образоваться много ядер или увеличиться число хромосом; укрупняются вакуоли.

Каллус, выращиваемый поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенную структуру. Клетки каллуса либо бесцветны, либо имеют желтоватый оттенок. В зависимости от происхождения и условий культивирования различают каллусы: рыхлые, с сильно оводненными, легко отделяющимися друг от друга клетками; средней плотности, с зонами меристематическои активности; плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов.

В биотехнологии, для отработки методик культивирования, чаще всего используют те виды растений, которые и в обычных условиях легко укореняются, регенерируют, образуют каллус. Поэтому большинство методов получения и культивирования каллуса разработано для табака. Каллусы можно получить практически из любой части растения, так как клетки табака легко дедифференцируются и переходят к пролиферации. Для культивирования каллусов из листьев табака используют среду Мурасиге-Скуга с добавлением ауксинов (2,4 Д).

Материалы и оборудование. Растения табака, 6 % раствор хлорамина, колбы со стерильной дистиллированной водой, чашки Петри со стерильной питательной средой для индукций каллусогенеза.

Ход работы.

1. Листья табака поместить в стерилизующий раствор на 5 минут, затем промыть стерильной дистиллированной водой 3 раза.

2. Стерильным скальпелем вырезать срединную жилку листа с участком паренхимы: длиною 1,5–2 см, шириной 1 см.

3. Поместить экспланты на питательные среды (перед каждой манипуляцией инструменты обрабатывать спиртом и обжигать на пламени спиртовки).

4. Чашки Петри с эксплантами перенести в термостат для индукций каллусогенеза при температуре 25 + 2 °C.

5. Результаты зарисовать через 2–4 недели.

Работа 2. ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСОВ ИЗ НЕЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ И УЗЛОВ КУЩЕНИЯ ПШЕНИЦЫ.

Объяснение. Каллусы из различных органов пшеницы на искусственных питательных средах впервые были получены в 1968 году. Их можно использовать для изучения солеустойчивости, устойчивости к температурному стрессу, получения суспензий и протопластов.

Для индукции каллусогенеза обычно используют стерильные пробирочные растения, выращенные из зародышей на средах без гормонов.

Растения для получения каллусов можно вырастить в теплице. Для этого набухшие семена помещают на 5 недель в холодную камеру на яровизацию при 2 °C, проростки высаживают в вегетационные сосуды и выращивают до достижения молочною спелости. Незрелые зародыши выделяют и переносят на питательные среды.

Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с питательной средой, пробирки со стерильными растениями, колосья пшеницы в стадии молочной спелости, инструменты: препарировальные иглы, пинцеты, скальпели, стерильная бумага, 6 % раствор хлорамина, стерильная дистиллированная вода, спиртовки, флаконы с 96 % спиртом.

Ход работы.

1. Незрелые зерновки поместить в стерилизующий раствор на 5 минут.

2. Промыть 3 раза стерильной дистиллированной водой.

3. Простерилизованные зерновки поместить на стерильные бумажные мости ки.

4. Препарировальной иглой вычленить зародыши и перенести в пробирки с питательными средами.

5. Пробирки с зародышами закрыть пробками и поставить в штатив.

6. Пробирочные растения пшеницы выложить на стерильные бумажные матрасики и разрезать на небольшие части по 5-10 мм, выделить междоузлия с участками листового влагалища.

7. Перенести экспланты на питательные среды МС + 2,4 Д в концентрации 4 мг/л.

8. Зарисовать каллусы через 2–4 недели, сделать выводы о морфологии каллусов, рассмотреть каллусные клетки под микроскопом.

Работа 3. ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСОВ ИЗ КОРЕШКОВ ФАСОЛИ.

Объяснение. Каллусы можно получать из разных частей растения, в том числе из кончиков корней. Образование каллуса происходит в области первичных и вторичных меристем. Процесс каллусообразования зависит от размера экспланта. Оптимальная величина экспланта 5-10 мм3 и масса 20-100 мг.

Многие ткани имеют физиологическую полярность. Поэтому каллус лучше образуется на той стороне экспланта, которая ближе к апикальным меристемам корня. Кончики корней легко образуют каллус, если они помещены на среду горизонтально, тогда как сегменты стебля лучше формируют каллус, если их поместить вертикально.

Для культивирования на питательных средах лучше использовать стерильные корешки, полученные при проращивании семян в стерильных условиях.

Материалы и оборудование. Семена фасоли, 6 % раствор хлорамина, стерильные инструменты: пинцеты, скальпели, препарировальные иглы, чашки Петри с пита тельными средами для индукции каллусогенеза, стерильные чашки Петри, флаконы со спиртом и стерильной дистиллированной водой.

Ход работы.

1. Семена фасоли поместить в чашки Петри (по 15 штук в чашку), залить раствором хлорамина до полного погружения семян в жидкость и оставить на 20 минут.

2. Промыть семена стерильной дистиллированной водой 3 раза.

3. Стерильные семена залить стерильной водой и оставить для набухания на 24 часа.

4. Семена с разрушенной кожурой удалить, а жизнеспособные семена простерилизовать повторно 6 % хлорамином 20 минут.

5. Промыть семена стерильной дистиллированной водой 3 раза.

6. Семена перенести в стерильные чашки Петри (по 5 штук в чашку).

7. Стерильным пинцетом придерживать семя, а стерильным скальпелем надрезать оболочку.

8. Стерильным скальпелем и препарировальной иглой изолировать корешки (2-

3 мм) и перенести в чашки Петри со стерильной дистиллированной водой (по 15 штук в чашку).

9. Корешки стерильной препарировальной иглой поместить на поверхность агаризованной среды и слегка вдавить в агар для обеспечения хорошего контакта со средой (среда ШХ+10 мг/л п-ХФУК+2 мг/л 2,4Д+0,1 мг/л кинетина).

Работа 4. СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕ КАЛЛУСОВ.

Объяснение. В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений проходят обычный онтогенез: растут растяжением, дифференцируются и деградируют. Рост каллуса внешне отражает образная кривая. Ростовой цикл начинается с посадки экспланта на среду (начало культивирования), а завершается в момент прекращения митозов (стационарная фаза).

В лагфазе (латентной