Шрифт:
Интервал:
Закладка:
При необходимости дополнительного подтверждения идентичности двух образцов гашиша можно определить (см. II гл.) зольность и количество веществ, растворимых в органических растворителях в аппарате для автоматической экстракции. Для этой цели пригодны петроленный эфир, эфир, бензол и метанол. Совпадение результатов анализа в двух образцах доказывает их идентичность. Недостатком указанных методов является их длительность и необходимость иметь значительное количество вещества для анализа (несколько граммов).
Кортэ и Зипер описали метод определения компонентов гашиша с использованием тонкослойной хроматографии (ТСХ) на кизельгеле Мерка. Подвижная фаза — циклогексан. Распределение компонентов такое же, как на бумаге. Обнаружение проводилось различными реагентами. Среди них реагент Бима — 5 %-ный раствор едкого кали в абсолютном спирте — дает пурпурное окрашивание только при наличии каннабиноидов, у которых оба фенольных гидроксила свободны, то есть у КБД, КБДК, КБГ. Так как эти вещества всегда присутствуют в конопле, реагент считается специфическим для качественного определения гашиша. При опрыскивании раствором так называемой «голубой соли» (хлорид ди-о-анизидинтетразолия в 0,1 н. NaOH) каннабиноиды образуют различно окрашенные пятна.
Таким путем авторам удалось доказать, что как индийская, так и обыкновенная (европейская, посевная) конопля содержат одинаковые фенольные компоненты.
В 1971 г голландский химик Меркус опубликовал критический обзор способов разделения компонентов конопли методом ТСХ. Автор рекомендует проводить анализ по следующей прописи:
100 мг гашиша встряхивают в пробирке с 8 мл петролейного эфира. Экстракт фильтруют и дважды повторяют извлечение. Объединенные фильтраты выпаривают, остаток растворяют в нескольких каплях хлороформа и наносят на пластинки с силикагелем. Обнаруживают вещества раствором «голубой соли».
Этот метод позволяет четко определить КБД, КБН и ТГК. Кроме того, он пригоден для разделения метаболитов каннабиноидов, найденных в моче человека после приема гашиша.
Преимущество метода тонкослойной хроматографии — в быстроте анализа (20–30 мин.). Недостатком всех качественных методов является то, что удается зафиксировать наличие только главных по содержанию каннабиноидов; изомеры и минорные вещества при этом не выявляются. Вместе с тем весьма важно было бы знать не суммарное содержание изомеров ТГК, а каждого в отдельности.
4.2 Количественные и полуколичественные методы
Метод ТСХ был модернизирован для полуколичественных определений важнейших каннабиноидов. Азокрасители с цветных пятен, полученные после опрыскивания диазотированным амином, элюировались спиртом, и интенсивность окраски оценивалась спектрофотометрически в видимой области. Предварительно строились калибровочные кривые для каждого индивидуального компонента. Этим методом были проанализированы экстракты конопли и гашиша из разных стран мира; показано, что количественные соотношения фенольных веществ варьируют в широких пределах. Несмотря на сравнительную простоту метода, точность оказывается не столь высокой.
Клауссеи, Боргер и Кортэ использовали для анализа экстрактов конопли газовую хроматографию (ГЖХ). Фрактограмма одной пробы гашиша испанского происхождения показала наличие по меньшей мере одиннадцати индивидуальных веществ, в том числе трех изомеров ТГК. Хотя не все вещества точно идентифицированы, по размерам пиков (времени удерживания) можно было судить о количественном соотношении компонентов. Здесь следует принять во внимание вероятность декарбоксилирования фенолокислот при высокотемпературном режиме газовой хроматографии. Тем не менее, данные газовой хроматографии являются наилучшей и наиболее полной характеристикой анализируемых образцов.
Этим методом в сочетании с тонкослойной хроматографией были проанализированы многочисленные образцы гашиша и конопли, решены многие практически важные вопросы. Выявлена определенная зависимость состава каннабиноидов от климатических условии произрастания конопли. В растениях северных районов земного шара гашиш менее активен (отличается пониженным содержанием изомеров ТГК) по сравнению с южными.
С помощью ТСХ авторам удалось установить режим реакции, при которой происходит циклизация КБД в различные изомеры ТГК. Показано, например, что при нагревании до 300° КБД образует не только всю гамму изомеров ТГК, но частично дегидрируется в КБН и распадается на оливетол. Изучено влияние ультрафиолетового света и кислорода на ход этой реакции.
Авторы проследили за изменением соотношения между каннабиноидами в листьях и соцветиях конопли в процессе вегетации растения. При этом было обнаружено преобладание КБДК в начальной стадии развития растения и увеличение менее полярных каннабиноидов в последней стадии вегетации. Высказано даже предположение о роли КБДК как материнского вещества, которое по мере роста растения, а также ферментативных процессов при хранении постепенно превращается в КБД и ТГК. Этим они объясняют и различие в физиологической активности обыкновенной (более богатой КБДК) и индийской конопли (содержащей больше ТГК).
Японским химик Авамаки с сотрудниками нашли, что при ТСХ на силикагеле в системе бензол, н-гексан и диэтиламин (25:10:1) четко разделяются КБН, ТГК и КБД (Rf соответственно 0,25: 0,35; 0,45).
Для опрыскивания хроматограмм были испытаны различные реагенты. Лучшими признаны диазотированный бензидин и «голубая соль», которые дают окраску пятен, позволяющую различать важнейшие каннабиноиды.
ТСХ в приведенных условиях рекомендуется для судебно- и химических исследований.
В той же системе растворителей проводилось и препаративное разделение на колонке с силикагелем. Полученные фракции группировались по данным тонкослойной хроматографии; константы полученных веществ соответствовали литературным данным.
Своеобразна методика подготовки образцов для анилина: предварительно высушенные и измельченные в порошок растения (навеска точно 1 г) выдерживались в закрытых сосудах в 10 мл спирта в течение 2 дней. Экстракты выпаривались досуха, снова растворялись в небольшом количестве спирта и отделялись от выпавшего воска фильтрованием. Фильтрат разбавлялся точно до 10 мл спиртом. В 1 мл такого раствора содержится сумма каннабиноидов из 0,1 г растения. Стандартные растворы индивидуальных каннабиноидов готовились так, чтобы 0,1 мкг вещества содержалась в 1 мкл растворителя.
Приготовленные растворы использовались для ГЖХ. Хроматограф Shimadzu model GC-1B с пламенным водородным ионизационным детектором. Колонка из нержавеющей стали U-образная, 2,25 м х 4 мм, содержала 1,5 % SE-30 на Chromosorb W (60–80 меш), обработанного гексаметилдисиланом. Температура колонки 220°, испарителя — 290°. Скорость потока азота 35 мл/мин. Относительное время удерживания КВД, ТГК и КБН соответственно 4,92; 6,58; 8,17 хорошо согласуется с данными для чистых веществ, хотя на фрактограмме были и другие мелкие пики. В качестве стандарта