Первые 77 «Спитфайров» получили деревянные двухлопастные винты. Начиная с 78-го экземпляра стандартом стал металлический трехлопастный винт «Де Хевиленд». К тому времени все самолеты получили выпуклые фонари кабины. В крылья подавался теплый воздух от работающего двигателя, обдувающий пулеметы. О наличии системы обдува пулеметов теплым воздухом свидетельствовало небольшое выпускное отверстие на нижней стороне крыла за пулеметами.

Тем временем встал вопрос о вооружении самолета более мощным оружием. Выбор руководства Королевских ВВС пал на французскую 20-мм пушку «Испано», как имевшую наибольшую пробивную способность. В июле 1939 года в Мартлсхем-Хит состоялись испытания «Спитфайра» L1007, вооруженного двумя пушками «Испано» с боекомплектом 60 выстрелов на ствол вместо восьми штатных пулеметов. Хотя две пушки весили на 4,5 кг легче восьми пулеметов, максимальная скорость уменьшилась на 5 км/ч из-за массивных стволов и обтекателей барабанов с боекомплектом. Во время испытаний на полигоне в Орфорднесс пушки постоянно отказывали, особенно после резких маневров. Выяснилось, что пушка «Испано» проектировалось для установки в развале блока цилиндров двигателя. Массивный двигатель должен был брать на себя энергию отдачи. Установка пушки в крыле привела к тому, что пушка деформировалась при стрельбе. 13 января пайлот-офицер Джордж Праудмен провел первый воздушный бой на пушечном «Спитфайре». Летчик атаковал немецкий бомбардировщик Не 111. Прежде чем обе пушки отказали, он успел сделать один выстрел из правой и 30 выстрелов из левой пушки. Тяжело поврежденный бомбардировщик был добит другим истребителем. Этот бой показал как эффективность пушечного вооружения, так и низкую надежность пушек «Испано».

Первые бои с Bf 109 состоялись во время эвакуации Дюнкерка. К тому времени «Спитфайры» уже заметно отличались от машин первой производственной серии. Внешне они отличались трехлопастными винтами «Ротол» или «Де Хевиленд» с автоматической регулировкой шага, а также толстым лобовым бронестеклом. В хвостовой части самолета установили устройство определения «свой-чужой» (Identification Friend or Foe — IFF), антенны которого проходили по обоим бортам до хвостового оперения. Самолет оснастили бронеплитами общей массой 33 кг. Плиты находились под сиденьем и за спинкой кресла пилотов, а также перед баками с топливом и этиленгликолем. Сверху верхний бензобак закрывал лист обшивки большей толщины.

Весной 1940 года самолеты стали заправлять бензином с октановым числом 100 вместо 87. Хотя на высотах более 5000 м это практически никак не сказывалось на характеристиках самолета, на небольших высотах удалось поднять давление во впускном тракте с 4,3 до 8,3 гПа без риска детонации. В результате мощность двигателя повысилась. На уровне моря максимальная скорость возросла на 40 км/ч, а на высоте 3000 м — на 55 км/ч.

В результате всех переделок взлетная масса самолета увеличилась на 152 кг до 2792 кг. Некоторые элементы сказались на скорости самолета. Так, лобовое бронестекло стоило 10 км/ч, а антенны устройства «свой-чужой» — 3 км/ч. Обычно в качестве скорости «Спитфайра I» — 582 км/ч (362 миль/ч) на высоте 5640 м (18500 футов) — приводится скорость первого серийного самолета К9787, весившего 2640 кг. Летом 1940 года максимальная скорость полностью оснащенного серийного «Спитфайра Mk.I» составляла всего около 560 км/ч на той же высоте.

Поздней весной 1940 года было решено, что пушечная модификация достаточно доведена, чтобы ее использовать на фронте. Для различения пушечного и пулеметного варианта им присвоили обозначения: Mk.IB и Mk.IA соответственно.

«Битва за Англию» стала экзаменом для всех Королевских ВВС. По сравнению с Bf 109Е — главным соперником «Спитфайра Mk.I» — английский истребитель был немного быстрее на высотах до 4500 м и немного медленнее на высотах более 6000 м. Практически на всех высотах и скоростях «Спитфайр» превосходил «Мессершмитт» на горизонтали, зато «Мессершмитт» превосходил «Спитфайр» на вертикали. Но упомянутые различия между обоими истребителями были минимальны. В реальном бою гораздо сильнее ощущались тактическое превосходство: кто первым заметил противника, кто имел преимущество в высоте, кто зашел со стороны солнца, у кого лучше координированы действия, и т. д.

«Спитфайр» отрывался от «Мессершмитта», уходя в вираж. «Мессершмитт» отрывался от «Спитфайра», уходя в пике. «Мессершмитт», оснащенный двигателем с непосредственным впрыском топлива, увереннее проводил резкие маневры, тогда как «Спитфайр», оснащенный поплавковым карбюратором, неуверенно себя чувствовал в резких маневрах. Столкнувшись с этой проблемой специалисты из «Роллс-Ройса» и в Фарнборо лихорадочно искали выход в создавшейся ситуации. Такое решение удалось найти, но быстро внедрить его не смогли.

Чтобы лично ознакомиться с проблемами боевого применения самолета, Джеффри Квилл в августе-сентябре 1940 года служил в составе 65-й эскадрильи в Хорнчерче. 16 августа он сбил Bf 109, а 18 участвовал в коллективной атаке на Не 111. Вернулся он на фирму с четким представлением о том, что нужно изменить в конструкции самолета. Важнее всего было наладить работу элеронов при пикировании с большой скоростью. При скорости больше 640 км/ч элероны, по сути, блокировались, и пилоту приходилось прикладывать огромные усилия, чтобы хоть немного отклонить их от нейтрального положения. (Надо заметить, что на Bf 109 имелась та же проблема).

Причину блокировки элеронов на большой скорости вскоре удалось установить. Воздушный поток выгибал матерчатую обшивку элерона вверх, при этом задняя кромка элерона становилась толстой и парусила. Было решено заменить матерчатую обшивку элеронов металлической. В ноябре 1940 года Квилл облетал самолет с новыми элеронами и нашел, что проблема практически решена. «Спитфайр» с металлическими элеронами направили в Тангмер, где его принял командир 602-й эскадрильи Сэнди Джонстоун. Вскоре он составил рапорт, в котором отметил: «Эффективность новых элеронов возросла настолько, что я бы не поверил, если бы сам не испытал самолет». Тут же началась замена элеронов на всех самолетах.

Вернувшись на завод, Квилл доложил о плохом обзоре назад. Многие пилоты были сбиты прежде чем заметили севшего на хвост противника. Он предложил два решения: одно временное, другое кардинальное. Временное решение предусматривало установку фонаря, выгнутого не только вверх, но и по бокам, так чтобы пилот мог заглядывать назад. Кардинально решить проблему с обзором назад Квилл предлагал, оснастив истребитель каплевидной кабиной. Это предложение Квилла внедрили в конструкцию самолета лишь четыре года спустя.

После дополнительной доработки самолет «Спитфайр Mk.IB» в ноябре 1940 года направили в 92-ю эскадрилью. Для пушки разработали специальный жесткий лафет, поэтому ее надежность заметно возросла. Но «битва за Англию» уже фактически закончилась и пушечные «Спитфайры I» одержали лишь единичные победы. В качестве компромиссного варианта предложили вооружить самолет двумя пушками и четырьмя пулеметами калибра 7,7 мм. Эту схему опробовали на самолете Х4257 летом и осенью 1940 года. Позднее такая схема вооружения стала основной и применялась на подавляющем большинстве истребителей «Спитфайр».

На базе «Спитфайра Mk.I» создали ряд специализированных вариантов, в том числе «Спид Спитфайр» и целое семейство разведывательных машин. Некоторые модификации затронули только по одной машине. На базе R6722 создали поплавковый гидросамолет (хотя он так никогда и не взлетал с воды). Самолет К9791 претерпел целый ряд переделок, получая разные винты, деревянные макеты пушечного вооружения, подвесные бензобаки под крыльями. Самолет Р9565 получил один 180-литровый бензобак под левым крылом.