Так или иначе, принц Джем отошел в мир иной, и у его брата-султана теперь были развязаны руки в отношении Родоса. Турки предприняли несколько нападений на острова Додеканесского архипелага и на сам остров Родос, избегая, впрочем, осады крепостей и ограничиваясь опустошением орденских угодий. Согласно поступавшим на Родос сведениям, Баязид II, следуя примеру своего отца, готовился нанести орденскому островному государству решительный удар.

В 1503 г. скончался Великий Магистр рыцарей Родоса и победитель турок Пьер д’Обюссон, за свои заслуги в борьбе с врагами христианства отмеченный папой титулом «Кардинала и Легата Азии». Его преемником стал Эмери д’Амбуаз, отпрыск знатного французского рода.

В то время как орденские дипломаты прилагали все усилия к объединению сил государей Запада против общего врага – османов, – корабли родосских рыцарей захватывали все новые мусульманские суда и регулярно наносили удары по вражескому побережью. Наиболее успешными оказались две операции иоаннитов, пришедшиеся на 1507 и на 1510 гг. Первой из них был захват иоаннитами в 1507 г. крупнейшего корабля и гордости египетского флота «Моргабины», имевшего на борту множество знатных пассажиров и дорогих товаров, вскоре после отплытия мамелюкского судна с Крита. Захватив «Моргабину», рыцари Родоса перестроили ее и переименовали в «Санта Марию». Она стала крупнейшим кораблем иоаннитских военно-морских сил, вошедшим в историю как «Большая Каракка». Второй операцией было неожиданное нападение двух орденских эскадр, одной из которых командовал Филипп Вилье де л’Иль-Адан, а другой – Андре д’Амараль, на порт Александретту, где стояло несколько десятков египетских судов, груженных лесом. Иоанниты захватили 10 больших египетских торговых судов и четыре военные галеры и благополучно вернулись на Родос с захваченными кораблями, грузами и большим количеством пленных.

В 1512 г. умер Эмери д’Амбуаз. Великим Магистром был избран Ги де Бланшфор. Впрочем, новый гроссмейстер, находившийся в момент своего избрания во французских владениях ордена, умер по пути из Франции на Родос от неизвестной болезни, так и не вступив в должность. Вместо него был избран итальянец Фабрицио дель Каретто. В период его правления на Родосе турки стали сильны, как никогда. Их султаном стал Селим I, сын Баязида II. В 1514 г. Селим победил шаха Персии. В 1516 г. турки завладели всей Сирией, а в 1517 г. завоевали Египет.

Угроза Родосу все возрастала. Фабрицио дель Каретто форсировал фортификационные работы на острове. Одновременно он направил в Европу в качестве своего полномочного дипломатического представителя Филиппа Вилье де л’Иль-Адана. Несмотря на все настоятельные просьбы орденского дипломата о помощи, папа и доблестный французский «король-рыцарь» Франциск I, занятые борьбой с римско-германским императором и королем Испании Карлом V Габсбургом в Италии, смогли предоставить рыцарям Родоса лишь незначительную помощь людьми и военными материалами. Селим, наряду со своим султанским титулом принявший духовный титул «халифа ислама» (духовного главы всех мусульман), в 1519 г. подчинил свой власти весь Аравийский полуостров. Казалось, что для Родоса настал последний час. Однако падишах Селим скончался в 1520 г. На престол в Стамбуле взошел его сын, Сулейман Великолепный, или Кануни (Законодатель). Через год умер и Фабрицио дель Каретто. Великим Магистром был избран Филипп Вилье де л’Иль-Адан.

29 августа 1521 г. Сулейман овладел Белградом – «вратами в Среднюю Европу» – и обратил свои взоры на Родос, поскольку гарнизон и флот родосских рыцарей преграждали туркам беспрепятственное морское сообщение с Сирией и Египтом. Сложившаяся к тому времени международная военно-политическая обстановка в Западной Европе была как никогда неблагоприятной для иоаннитов. Император Карл V Габсбург и Франциск I Французский намертво вцепились друг в друга в смертельной схватке, в которую были вовлечены и более мелкие властители европейских государств. Эта война не только делала невозможным присылку с Запада военной помощи на Родос, но и не позволяла большинству членов ордена прибыть из Европы на остров, чтобы принять участие в его обороне. Венеция не желала портить сложившиеся у нее с турками мирные отношения, приносившие ей огромные доходы от торговли с Востоком.

Тяжелая ситуация, в которой оказался орден родосских рыцарей, разумеется, не была секретом для турок. Они решили воспользоваться представившейся им возможностью и напасть на Родос, коль скоро он оказался в одиночестве, лишенным всякой помощи со стороны. Сведения, поступавшие к Великому Магистру, были самыми неутешительными. В конце 1521 г. Марко Минио, венецианский посланник при дворе падишаха в Константинополе, докладывал о крупномасштабных военных приготовлениях турок. На султанских верфях ремонтировались и строились новые военные корабли, нанимались матросы и солдаты. Согласно предположениям одних информаторов, турецкий флот должен был напасть на Кипр, согласно предположениям других – на остров Керкиру (Корфу), или даже на Италию. Мало кто говорил об опасности, могущей угрожать Родосу. Тем не менее беспокойство иоаннитов все возрастало, и они принимали все новые меры к укреплению обороны острова. Родосцы углубляли рвы, наращивали крепостные стены и конкретизировали планы на случай осады, определяя пост на стене для каждого бойца каждого орденского «языка». По мнению многих историков, главная крепость Родоса была на тот момент самой современной и неприступной из всех, существовавших на тот момента в Западном мире. Гарнизон острова состоял из 300 рыцарей ордена Св. Иоанна, 7500 итальянских наемных воинов и моряков, критских лучников (известных своей меткостью еще с античных времен) и родосских ополченцев. Специальным комитетам при важнейших должностных лицах ордена были поручены организация снабжения съестными припасами и военными материалами и надзор над соответствующими работами.

26 июня 1522 г. на остров Родос высадилось турецкое войско. Верховным главнокомандующим турок был Мустафа-паша, зять султана и второй визирь. Его сопровождал и первый (Великий) визирь, Пири Мехмет-паша. Под стенами города Родос снова засверкали турецкие бунчуки, увенчанные серебряными полумесяцами. Сухопутные силы турок состояли из 100 000 бойцов, включая 10 000 янычар и более 60 000 саперов, специально обученных искусству минных работ и разрушения фортификационных сооружений. На первом этапе осады Родос был блокирован с моря 280 турецкими кораблями разной величины. По мере продвижения турецких осадных работ, количество османских кораблей постепенно увеличилось до 400. Гарнизон города Родос состоял из 290 рыцарей ордена Св. Иоанна и (по разным источникам) от 6000 до 7500 сержантов и наемных солдат. Сельское греческое население, для которого не нашлось места в орденских крепостях Линдос, Фараклос и Монолитос, с семьями и домашней скотиной укрылось за стенами Родоса. Во время осады крестьяне-греки привлекались иоаннитами к вспомогательным работам.

По сравнению с осадой 1480 г. турки изменили свою тактику. Теперь их главные удары были направлены на орденские укрепления не со стороны моря, значительно усиленные родосскими рыцарями за прошедшие со времен прежней осады десятилетия, а со стороны суши. Со стороны моря османы ограничились блокадой обоих орденских портов силами своего гигантского флота.