При открытии в Марфо-Мариинской обители было всего 6 сестер, но за год число их возросло до 30 человек, поэтому в 1911 г. был выстроен 3-этажный дом. На верхних этажах разместилось общежитие для сестер, на первом – дортуар приюта, две комнаты для занятий рукоделием и бельевая.

Все дома обители (кроме дома священника) были соединены ходами, так что можно было обойти их, не выходя наружу. В 1909 г. великая княгиня Елизавета Федоровна купила еще участок земли, который прилегал к саду обители. И имеющийся там дом был приспособлен частью для призреваемых, а частью для приезжавших в обитель гостей.

В Марфо-Мариинскую обитель милосердия принимали вдов и девиц православного вероисповедания (не моложе 21 года и не старше 40 лет), которые желали посвятить свою жизнь служению Богу и ближним. Если желающей поступить в сестры было меньше 21 года, но она отвечала всем требованиям обители, ее могли принять как ученицу. У сестер должно было быть прочное духовное настроение и желание в смирении и терпении нести всякое послушание. Нужно было и физическое здоровье, необходимое при той работе, которую брали на себя сестры. Поэтому и не принимали женщин старше 40 лет, т. к. в эти годы трудно было уже рассчитывать на их долгую работоспособность и обители с самого начала своего существования пришлось бы думать об устройстве богадельни. Но в любом случае обитель становилась убежищем для своих престарелых сестер.

Марфо-Мариинская обитель оказывала всестороннюю помощь множеству страждущих москвичей. На ее территории размещались больница, амбулатория, аптека, приют для девочек, воскресная школа, библиотека, столовая для бедных, кружок «Детская лепта» и т. д. Все операции проводились в больнице бесплатно, а в амбулатории бесплатно выдавали больным лекарства, делали уколы, массаж и т. д. В ней было шесть кабинетов, в которых врачи работали безвозмездно.

Приют был организован для девочек – круглых сирот, которые в будущем готовились стать сестрами. Если же у них не было к этому призвания, они всегда могли найти работу, т. к имели основательную медицинскую подготовку.

Воскресная школа была устроена для безграмотных и полуграмотных женщин и девушек, работавших на фабриках. В воскресные дни они приходили в обитель в 1 час дня, учились до 3 часов, потом им давали чай с хлебом, после чего они занимались пением или чтением. Затем шли в храм, где во время акафиста участвовали в общем пении. Таким образом, эти девушки и женщины проводили свой выходной день в нравственных занятиях, а не в празднословии и пагубных увлечениях.

Столовая для бедных ежедневно отпускала на дом более 300 обедов, в основном, бедным женщинам, обремененным многочисленным семейством. Иногда благотворители заказывали поминальные обеды для бедных, и тогда в этот день усопших поминали и церкви обители.

«Детская лепта» устраивалась как кружок для детей, но в его работе могли участвовать и взрослые. Все собирались в воскресение работать для бедных детей, но по желанию работу (например, шитье) можно было брать и на дом. Ткани жертвовались добрыми и благочестивыми людьми, а детскую обувь тоже покупали на пожертвования.

Но главной обязанностью сестер было посещение больных и престарелых на дому. Закончив послушание в обители, они каждый день отправлялись к обездоленным, помогали и утешали их. Просьбы и прошения великая княгиня Елизавета Федоровна принимала без всяких различий, и ни один вопль о помощи не остался без ответа. Почти ежедневно сестры шли туда, где ютились болезни и нищета и где была нужна их помощь.

Работы было много и в самой обители, поскольку ее тоже обслуживали сами сестры. В больничном храме во имя преподобных Марфы и Марии сестры ежедневно (утром и вечером) читали молитвенное правило и Евангелие, духовник обители (протоиерей отец Митрофан Сребрянский) говорил назидательное слово на предстоящий день, потом сестры подходили поздороваться со своей августейшей настоятельницей. Каждую она обласкает, каждой скажет доброе слово, и только после этого сестры шли на послушание. Во все дни недели в домовой церкви совершались богослужения. А в субботу и воскресенье службы переносились в соборный храм, который был возведен по проекту академика архитектуры А.В. Щусева и посвящен Покрову Пресвятой Богородицы. Расписывал этот храм академик живописи М. В. Нестеров.

Правильное посещение больных началось только с 1913 г., а до этого времени сестры только готовились под руководством настоятельницы и духовника, слушали их беседы и наставления и проходили некоторый медицинский курс. Специальные медицинские сестры проходили более расширенный курс под руководством опытных врачей, а дополняли свои знания практикой в больнице и амбулатории обители.

Порой обитель оказывала и денежную помощь нуждающимся: плата за жилье, взнос за швейную машинку, уплата за обучение девушек, раздача детям и т. д. Но при всем этом главной заботой сестер оставалось нравственное и духовное воздействие на призреваемых. Люди обездоленные, проживавшие в так называемых «углах», более других нуждались в духовной помощи. Поэтому вовремя сказанное теплое и доброе слово ободряло их, давало силы и дальше безропотно продолжать трудовую жизнь в надежде на милость Божию.

С осени 1913 г. сестры Марфо-Мариинской обители распространили свою благотворительную деятельность и на известный в Москве «Хитров рынок». Они обходили ночлежные дома, делали по необходимости перевязки нуждающимся; извлекали из злачных мест детей и отправляли их в приюты, находили места тем безработным, кто еще не погряз в безнравственном омуте.

Во время Первой мировой войны работы сестрам прибавилось еще больше. В обители был открыт лазарет, в котором раненые получали лечение, покой и полный уход. Потом великая княгиня Елизавета Федоровна открыла мастерскую, где раненым, увечным и калекам делали прекрасные протезы. Жены ушедших на войну солдат могли получить дополнительный заработок, для чего в генерал-губернаторском доме была открыта швейная мастерская. А в деревнях великая княгиня открыла детские ясли, чтобы солдатки могли спокойно работать в поле, т. к. в яслях за детьми был хороший уход. Кроме всего прочего, великая княгиня Елизавета Федоровна занималась и организацией трудовых дружин из учащихся, чтобы они помогали тем, кто сам не мог управиться с полевыми работами

Марфо-Мариинская обитель жила по уставу, написанному самой великой княгиней Елизаветой Федоровной с благословения старцев Троице-Сергиевой лавры и Оптиной пустыни. Устав этот был основан на опыте многих монастырей, но в нем была одна особенность: для послушниц обители не был обязателен монашеский постриг, поэтому в ней могли трудиться и те, кто в будущем хотел создать свою семью. Сама Елизавета Федоровна строго исполняла все монашеские правила, но от сестер этого не требовала. Она была для послушниц примером самоотверженного служения людям и истинно христианской любви, и благодаря ее примеру бывшие сестры смогли исполнять свой христианский долг и после закрытия обители.

В 1918 г., в день празднования Иверской иконы Божией Матери, великая княгиня Елизавета Федоровна была арестована. Незадолго перед тем обитель посетил патриарх Тихон, который долго беседовал с настоятельницей, напутствуя ее перед крестным путем.