Кроме родного армянского, владел греческим, сирийским и персидским языками. Позже изучал кавказские языки.

Корюн сообщает, что Маштоц служил при дворе Аршакидов, царей Великой Армении. Другие источники сообщают, что он был назначен секретарем при армянском дворе, возможно, при дворе армянского царя Хосрова IV в течение нескольких лет.

Потом он переехал в Вагаршапат, что могло произойти не ранее 385 года. Здесь Маштоц был на военной службе, вероятно, был командиром, поскольку Корюн пишет, что «знанием ратного дела снискал (Маштоц) любовь своих воинов». Тогда же служил писцом и секретарем в царской канцелярии. Считается, что годы придворной службы сыграли важнейшую роль в формировании его дальнейших религиозных и политических взглядов.

Политическая ситуация в Армении в этот период была крайне обостренной. Под ударами как Римской империи, так и государства Сасанидов армянское государство сильно ослабло. Маштоц был непосредственным очевидцем политического раздела Армении в 387 году между этими двумя державами.

В 392–393 годах, будучи придворным служащим, Маштоц принимает христианство. В 395–396 годах он покинул царский двор и стал проповедником Евангелия среди армянских язычников. Падение Армянского царства привело к оживлению языческих верований.

Сначала Маштоц со сподвижниками обосновался в местечке Ротастак в области Гохтн (Голтн) вблизи Нахичевани. И он туда периодически возвращался из своих странствий. Маштоц устно переводил для людей Библию, которая тогда была на греческом и сирийском языках.

Спасение распадающегося армянского государства Маштоц видел только в укреплении христианской веры среди армянского народа. И он задумал создать национальный алфавит, который должен был стать средством развития армянской культуры, а также средством сохранения политической, религиозной и культурной самобытности армян.

Алфавит ему был нужен для перевода на армянский Библии и богослужебных книг. Первые попытки Маштоц предпринял, когда только начал проповедовать в конце 390 годов в Голтне и Сюнике, где его поддерживали местные князья. За содействием в создании армянского алфавита Маштоц обратился к католикосу, который разделил его идею, и они начали искать подходящий алфавит.

Для этого католикос созвал специальный церковный собор. В Вагаршапатский синод прибыли все епископы армянской церкви. Царь Врамшапух, вернувшись в то время из Месопотамии, узнал об этой идее и тоже поддержал ее. Он рассказал, что в Месопотамии существует древний армянский алфавит.

После собора царь послал в 404 году Вагрича Хадуни к сирийскому епископу Даниилу, и Хадуни привез так называемые «Данииловы письмена», происхождение которых точно не ясно до сих пор. Считается, что это были письмена алфавита армянского языка, найденные епископом Даниилом и относившиеся к более ранней исторической эпохе. Известно также, что Месроп Маштоц и католикос Саак Партев, будучи знакомы с существующими алфавитами их времени, приняли «Данииловы письмена» именно как древнеармянские и настойчиво пытались возродить их.

Царь Врамшапух приказывает использовать везде для обучения грамоте этот алфавит. Маштоц, получив степень вардапета (архимандрита), собрал первых учеников и начал обучение с использованием алфавита «Данииловых письмен». Однако данный алфавит не мог правильно зафиксировать фонетику тогдашнего армянского языка. Попытка оказалась неудачной.

Через некоторое время Маштоц совершил вторую попытку. На этот раз он сам создавал алфавит.

По приказу царя и с согласия католикоса Маштоц с группой учеников предпринял поездку в северную Месопотамию, в города Амид, Эдессу и Самосату. Точная цель ее сейчас неизвестна. Возможно, он надеялся на помощь месопотамских ученых, возможно, искал следы еще каких-нибудь древних армянских писмен. Например, в Эдессе он отправился в книгохранилище, изучил алфавиты разных языков, ознакомился с их структурой, формами букв, принципами письма и только после этого взялся за создание алфавита.

Своих учеников Месроп разделил на две группы: одних оставил в Эдессе для изучения сирийской письменности, других отправил в город Самосата для изучения греческой письменности.

К 405 году в городе Эдесса Маштоц создал 36-буквенный армянский алфавит. Он расставил буквы в прямом соответствии с буквами греческого алфавита. После этого он отправился в город Самосата, где с греческим писцом и каллиграфом Ропаносом уточнил начертание армянских букв. И там же Маштоц, два его ученика и Ропанос начали перевод Библии, используя новый алфавит, с притчей Соломоновых.

Месроп Маштоц стал первым переводчиком Библии на армянский язык, а Ропанос обучал учеников Маштоца как писцов новой армянской письменности. После посещения сирийского епископа Маштоц с учениками возвратился в Армению. Католикос Саак предоставил Маштоцу группу ученых-монахов, вместе с которыми ученый окончательно определил фонетические и орфографические нормы армянского языка.

По возвращении в столицу Маштоц по приказу царя начал обучать жителей области Марк. Потом при поддержке католикоса он основал Вагаршапатскую семинарию – первую высшую школу христианской Армении, куда стали собираться ученики с разных концов и областей страны. Маштоц возглавил также обучение царского двора вместе со всем азатским войском. Первые армяноязычные школы были созданы по типу греческих. Маштоц разработал методику преподавания армянского языка. Он и его помощники учили не только грамотности, но и церковному песнопению.

После создания алфавита в деятельности Маштоца начинается новый этап. Получив согласие царя и католикоса, с группой учеников он снова начал проповедовать в провинциях страны. В 410-е годы Маштоц распространил новый алфавит в большей части Восточной Армении.

В 414 году умер царь Врамшапух – главная государственная опора деятельности Месропа Маштоца. После него на армянский престол был утвержден сын сасанидского самодержца Йездигерда I Шапур, а с 419 года в стране началось безвластие.

В эти годы Маштоц и Саак разослали по областям страны подготовленных учеников, доверив наиболее способным из них обучать грамоте и распространять христианство. И они начали перевод Библии на армянский. Поскольку после раздела Армении греческие книги в персидской ее части были запрещены, Месроп и Саак первые библейские переводы делали с сирийских текстов.

Завершив просветительскую деятельность в Восточной Армении, Маштоц с группой учеников и соратников отправился в Византию для основания армянских школ в Западной Армении. При этом духовенство Кесарии Каппадокийской считало эти области частью своего престола, применяли там греческую письменность и были возмущены деятельностью Маштоца и Саака.

Маштоцу пришлось отправиться непосредственно в Константинополь, чтобы получить разрешение на свою деятельность. Весной 420 года он с почестями был принят молодым императором Византии Феодосием II и получил его разрешение на просветительскую деятельность «со скрепленными печатью императорскими грамотами». Согласно императорскому приказу Маштоцу далось право собрать юношей в византийской части Армении. Согласно другой грамоте Маштоц должен был искоренить секту борборитов в этих провинциях. Также он получил одобрение и со стороны греческого патриарха Аттика. От византийских властей Маштоц получил титул акумит, буквально означающий «бдящий», «вечно бодрствующий», был рукоположен экклесиастиком и записан в числе первых наставников.