Классификация художественных произведений из дореволюционных собраний подчинялась жесткой государственной политике в области музейного дела. В 1925 году работы французских живописцев, собранные Сергеем Михайловичем Третьяковым, были переданы в Музей изящных искусств (ныне ГМИИ). Государственный музейный фонд был ликвидирован в 1927 году, а его хранение распределено по музеям. В этом же году Третьяковская галерея получила работы русских художников из коллекции И.А. Морозова, которые и сегодня украшают музей.

Развитие межмузейных связей также давало возможность расширить фонды. В течение 1920–1930-х годов несколько значительных произведений петровской эпохи передала Оружейная палата. Два портрета И.Н. Никитина, «Портрет П.А. Демидова» (1773 г.) кисти Д.Г. Левицкого были получены из Русского музея. Из бывшего собрания Сената поступили парадные портреты – «Портрет Петра III» (1762 г.) А.П. Антропова и «Портрет императрицы Елизаветы Петровны» (1743 г.) И.Я. Вишнякова.

Рост фондов требовал помещений для их размещения. Уже многие экспозиционные залы были отданы под запасники. В галерее скопилось около 15 тысяч произведений, многие из которых не были окончательно закреплены за музеем. К 1923 году экспозиция, которую с таким вдохновением создавал И.Э. Грабарь, сильно изменилась.

Академик архитектуры А.В. Щусев, ставший директором в 1926 году, и сменивший его на этом посту М.П. Кристи приложили немало усилий для увеличения музейных площадей. В 1927 году галерея получила соседний дом по Толмачевскому переулку (бывший дом Соколикова). После перестройки в 1928 году в нем разместились администрация, научные отделы, библиотека, отдел рукописей, фонды графики. Это здание присоединялось к основному пристройкой. Церковь Николы в Толмачах, переданная Галерее в 1929 году, стала запасником живописи и скульптуры. Позже отсюда был сделан проход в заново выстроенный двухэтажный корпус с экспозиционными залами, верхний этаж которого был специально оборудован для картины А.А. Иванова «Явление Христа народу» (1837–1857).

Благодаря присоединению многих коллекций собрание живописи этого периода не уступало ни по количеству, ни по качеству экспозиции искусства второй половины XIX века. На нижнем этаже (14 залов) были выставлены работы художников рубежа XIX – ХХ веков и современных мастеров. Особенно широко было представлено творчество К.А. Коровина, В.А. Серова, М.А. Врубеля. В трех последних залах демонстрировалось современное искусство.

В 1930 году была создана «Опытная комплексная марксистская экспозиция» по искусству XVIII – первой половины XIX века, в которой творчество художников прошлого попытались показать с точки зрения «классового истолкования явлений искусства». Картины в залах сопровождались фотоснимками, подробным этикетажем, их окружали предметы быта. Очевидная вульгаризация принципов экспонирования была бессовестной профанацией музейного дела и дискредитировала благородные идеи основателя галереи.

Социологический подход диктовал и темы выставочной работы: «Антиалкогольная» (1929 г.), «Красная Армия в советском искусстве» (1930 г.), «Революционная и советская тематика» (1930 г.), «Плакат на службе пятилетки» (1932 г.).

В 1920-е годы главным считалось показать зрителю различные направления современного искусства, в 1930-е этот метод был осужден как позиция «мнимой объективности». Началась «борьба с формализмом». Из экспозиции Галереи на 25 лет изгоняются «левые» художественные группировки 1910–1920-х годов. В ее залах во всей полноте был представлен ставший господствующим в искусстве метод соцреализма.

В 1932 году три новых зала связали основное здание галереи с помещением запасника в церкви Николы в Толмачах. Постройка перехода между залами, расположенными по обе стороны от главной лестницы, обеспечила непрерывность обзора. Началась работа над созданием новой концепции размещения произведений.

А четырьмя годами позже с северной стороны основного здания было закончено строительство «щусевского корпуса», органично вошедшего в панораму Лаврушинского переулка. Двухэтажная постройка, созданная по проекту архитектора А.В. Щусева, была мастерски соотнесена с исторической частью и васнецовским фасадом. Его просторные залы (четыре – в верхнем этаже и четыре – в нижнем) сначала использовались для выставок, а с 1940 года были включены в основной маршрут экспозиции.

В середине 1930-х годов Третьяковская галерея приняла первых посетителей, которые смогли познакомиться с новой экспозицией. Музей вернулся к прежнему, историко-хронологическому принципу показа своего собрания. Крупнейшие мастера, как и раньше, были представлены монографически. Тогда же, в тридцатые годы, был создан отдел советского искусства, в который регулярно передавались экспонаты после проведения грандиозных выставок современных художников, а также мастеров советских республик. Со второй половины 1930-х годов в галерее появилась традиция сопровождать выставки научными конференциями, на которые приглашались специалисты из других городов всего Советского Союза.

С первых дней Великой Отечественной войны в галерее начался демонтаж экспозиции. Картины были убраны со стен, вынуты из рам и сняты с подрамников. Музей готовился к отправке в эвакуацию.

В середине лета эшелон из 17 вагонов отправился с Казанского вокзала вглубь страны с экспонатами не только Третьяковской галереи, но и Государственного музея нового западного искусства, Государственного музея изобразительных искусств им. А.С. Пушкина, Музея восточных культур. Отвечал за весь груз директор Третьяковской галереи А.И. Замошкин.

Долгое путешествие до Новосибирска длилось больше недели. Новым домом музейных фондов страны стало недостроенное здание Оперного театра. Ящики ставили рядами по музеям и видам искусства вплотную один к другому, в два, а иногда и в три яруса. Временное хранилище было названо филиалом Государственной Третьяковской галереи, а его директором стал А.И. Замошкин.

Основная часть работы легла на плечи хранителей и реставраторов. Они круглосуточно дежурили в хранилищах, совершали ночные обходы, делали контрольные вскрытия ящиков.

А в Москве продолжались бомбежки. Только дважды фугасные бомбы падали на здание Государственной Третьяковской галереи – во время ночных налетов в августе и ноябре. Но этого было достаточно, чтобы разрушить строения галереи в нескольких местах.

В середине августа огромная баржа, построенная в 1913 году, со второй партией художественных произведений отплыла от Московского речного вокзала и почти сразу же попала в полосу воздушного боя. Поврежденную крышу удалось починить только в Горьком, где взяли на борт художественную коллекцию Государственного Русского музея. Далее вверх по Каме к месту назначения – в город Молотов (ныне Пермь). Груз сопровождали старший научный сотрудник М.М. Колпакчи и реставратор И.В. Овчинников. До конца эвакуации они самостоятельно несли ответственность за художественные произведения галереи в Молотове.

В Лаврушинском переулке оставалось все меньше сотрудников. Буквально в первые дни войны многие ушли в армию или народное ополчение. К зиме 1942 года в штате числилось не больше тридцати человек. В залах было холодно, отопление не работало, везде гулял ветер, в щели залетал снег. В таких условиях становилось крайне тяжело хранить экспонаты. В ноябре еще 109 ящиков отправилось в Новосибирск.