В поданной Анне Иоанновне челобитной (документ не имеет даты, но в бумагах следственной комиссии указано, что он приобщён к делу 16 апреля 1740 года) обер-камергер обвинил соперника в возведении «напрасного на безвинных людей сумнения» и прежде всего на него самого, кто «с лишком дватцать лет» несёт службу и «чинит доклады и представления». Заодно Бирон вспомнил, что кабинет-министр осмелился «в покоях моих некоторого здешней Академии наук секретаря Третьяковского побоями обругать». Волынскому ставили в вину не сами «побои», а нанесение их во дворце, что уже подходило под статью об оскорблении величества в духе «государева слова и дела».

Объединение двух мощных фигур сокрушило Волынского, хотя фавориту оказалось нелегко получить санкцию на расправу с соперником. Миних утверждал, что «был свидетелем, как императрица громко плакала, когда Бирон в раздражении угрожал покинуть её, если она не пожертвует ему Волынским и другими», а секретарь Артемия Петровича Василий Гладков на следствии дал показания, что Бирон, стоя перед Анной Иоанновной на коленях, говорил: «Либо ему быть, либо мне». Анну Иоанновну подталкивали к решению и другие царедворцы: давний противник министра обер-шталмейстер Куракин убеждал её, что Пётр I «застал Волынского уже на такой скверной дороге, что накинул ему петлю на шею». «Следовательно, если ваше величество не затянете петли и не повесите негодяя, то мне кажется, что в этом отношении желание и намерение великого государя не будет выполнено», — пересказал его оригинальную аргументацию саксонский посланник Зум 9 апреля 1740 года.

Тринадцатого апреля Анна отрешила Артемия Петровича «от егермейстерских и кабинетских дел» и потребовала пресечь «всякое с ним, Волынским, сообщение», изъять его «проэкт» и прочие бумаги и поднять прощённое казанское дело 1730 года. Через три дня начались допросы в специально созданной «генералитете кой комиссии». Дело вели Ушаков и ставленник Остермана Неплюев.

Поначалу обвиняемый держался уверенно, критиковал тех, кто ему «вредил», надеялся на благополучный исход и просил себе другую должность, «понеже я в прежнее своё место не гожусь». Но вскоре он понял, что дело серьёзное, и решил поменять тактику. Он становился на колени, кланялся комиссии, просил не «поступать с ним сурово» и признавал, что «всё делал он по злобе на графа Остермана, Куракина и Головина и поступал всё против их, думал, что был министр, и мыслил, что он был высокоумен, а ныне видит, что от глупости своей всё врал с злобы своей».

Восемнадцатого апреля последовал указ о «крепком карауле» для главного подследственного. В доме Волынского заколотили окна и опечатали все комнаты, кроме одной, в которой опальный министр жил, как в тюремной камере, при свечах. Чтобы арестант «отнюдь ни с кем сообщения иметь… не мог», в «горнице» безотлучно присутствовали два вооружённых солдата. К детям Артемия Петровича, содержавшимся в том же доме, но отдельно от отца, был приставлен особый караул.

Следователи понимали, что придворные дрязги и опрометчивое письмо Волынского, адресованное царице, политическими преступлениями не являлись. Надо было обнаружить что-то более серьёзное. Здесь кстати прийтись показания дворецкого Василия Кубанца. Несмотря на доверительное отношение Волынского, у холопа накопилось много претензий, да и погибать ради барина Василий не желал. Дворецкий вспоминал прегрешения хозяина, начиная с губернаторства в Казани: крупные взятки с татар, волчья шуба, полученная от сибирского вице-губернатора Бутурлина, кусок голубой парчи от мануфактуриста Гончарова, три штофа от симбирских купцов, 300 казённых брёвен, взятых на строительство дома министра…

Двадцать первого апреля Кубанца ознакомили с адресованным лично ему письмом Анны Иоанновны за её подписью: «Понеже ты объявил, что нечто донести имеешь, о чём однако ж, окроме нам самим, объявить не можешь, а нам тебя перед себя допустить нельзя, того ради повелеваем тебе то, еже нам самим донести имеешь, написать на писме и, запечатав, отдать асессору Хрущову, которой то нам самим за оною ж печатью подать имеет. Анна». Перепуганный и одновременно обнадёженный доносчик принялся писать «пополнения» к первоначальным показаниям. Он вспомнил, что хозяин не только «прославлял фамилию свою», но и читал предосудительную книгу Юста Липсия, сравнивая при этом государыню со средневековой неаполитанской королевой Иоанной и античными Клеопатрой и Мессалиной и заявляя: «Женский пол таков весь»; желал «погубить» Остермана, себя «причитал к царской фамилии» и даже «тщился сам государем быть». Наконец, дворецкий заявил, что его господин одобрял польские порядки и «хотел в государстве вашего величества республику зделать». Показания о «республике» не согласовывались с якобы имевшимся у Волынского намерением стать «государем» — но это уже не имело значения. Теперь можно было предъявить обвинения не только в служебных грехах, но и «по первым двум пунктам», то есть в государственном преступлении.

К государственным «видам» добавилась личная обида императрицы. Сочинение нидерландского гуманиста Юста Липсия «Увещания и приклады политические от различных историков» («Monita et Exempla politica») не являлось крамольным — его автор придерживался монархических убеждений, верно служил Габсбургам и не признавал никакого ограничения власти государя, за исключением его христианской совести. Другое дело, что он приводил, а Волынский использовал примеры дурного поведения «женских персон» у власти. Могла ли императрица допустить сравнение с неаполитанской королевой Иоанной I (1343–1382) — убийцей своего первого мужа, клятвопреступницей, отлучённой от Церкви и в конце концов задушенной по приказу своего же наследника? Анна помиловала и вознесла проворовавшегося холопа, а тот осмелился хулить свою благодетельницу и сравнивать её с неаполитанской блудницей. Напомнили Анне и о найденных в бумагах Волынского списках с «кондиций» и других проектов 1730 года. Подозрительная императрица лично составила вопросы, которые надлежало задать бывшему министру о памятных событиях 1730 года:

Раскручивавшееся дело контролировала и направляла сама императрица по ежедневным докладам Ушакова. Она повелела Волынского «со двора ево взять в адмиралтейскую крепость», а затем в казармы Петропавловской крепости. Сам он по-прежнему отрицал какие-либо преступные «замыслы», однако его «конфиденты» Ф.И. Соймонов и П.М. Еропкин сделали страшное признание, что их «патрон» «может чрез возмущение владетелем себя сделать». Помогло следствию и показание Волынского, что при составлении «картины» (родословного древа) он «причитался свойством к высочайшей фамилии», а его дети или их потомки могли бы когда-нибудь стать «российского престола преемниками».