Как только не именовался монастырь в царских и патриарших грамотах и летописях XVI–XVII вв. – и Дом Пречистой Богородицы, и Великая обитель Пречистой Богородицы Одигитрии, и Новый Девичий монастырь. Эта духовная обитель сразу получила высокий статус Царского богомолья, а вместе с ним и соответствующие льготы, огромные земельные вотчины, щедрые денежные вклады и приписных крестьян. В 1525 году сюда из Благовещенского собора Кремля был торжественно перенесен чудотворный образ Богоматери Одигитрии Смоленской. И с тех самых пор на протяжении 400 лет совершался ежегодный Крестный ход из Кремля в Новодевичий монастырь. В этом важном священном событии всегда участвовали русские правители и московское духовенство (до 1917 г.), а само шествие, являвшееся одним из любимейших столичными жителями праздников, всегда сопровождали широкие народные гуляния на Девичьем поле.

По повелению Василия III первой игуменией Новодевичьего монастыря стала известная среди современников подвижница, старица суздальского Покровского монастыря, прп. Елена «благоговейная и благочинная схимонахиня», «всеизрядная учительница девственного чина и вождь ко спасению известный». Вместе с Еленой из Суздаля прибыли 18 монахинь. Так в Новодевичей обители было положено начало монашеской жизни на основах строгого общежития. После игумении Елены остался уникальный документ, «Духовная грамота с наставлением о монастырском уставе», которая ныне являет собой единственный известный рукописный Устав женского монастыря первой половины XVI века.

С второй половины XVI и до кон. XVII века история Новодевичьей обители очень тесно связана с судьбами знаменитых царских династий. В стенах монастыря принимали постриг как представительницы царского семейства, так и знатных боярских родов. В 1549 г. Иван Грозный крестил, а через год похоронил в обители своего первого ребенка, младенца Анну. Здесь в 1564 году была пострижена княгиня Иулиания Дмитриевна Палецкая (в инокинях Александра), вдова великого князя Юрия Васильевича, младшего брата царя Ивана, а в 1582 году – Елена Ивановна Шереметева (в инокинях Леонида), вдова царевича Ивана, его убитого сына.

В 1598 году после кончины царя Федора Ивановича, в Новодевичий монастырь из Кремля переселилась овдовевшая царица Ирина Федоровна Годунова (в инокинях Александра). Здесь же с января по апрель 1598 года находился ее брат Борис Годунов, когда народ трижды приходил к нему с молением и просьбой взойти на российский престол. В этом же году в Смоленском соборе Борис был наречен государем. Стараниями Годунова был полностью обновлен Смоленский собор: сооружен новый иконостас, обновлены росписи, написаны несколько икон праздничного, деисусного, пророческого и праотеческого рядов. Эти иконы сохранились до нынешнего времени. Для вдовствующей царицы-инокини Борис Годунов возвел широкие палаты, которые получили название Ирининских, с домовой церковью Рождества Предтечи, сейчас именуемой Амвросиевской, а саму обители опоясал мощными каменными стенами с башнями, превратив тем самым монастырь в сильную крепость-заставу на западных подступах к столице.

В Смутное время Новодевичья обитель была довольно сильно разорена. Во время осады столицы в 1610–1612 годах стены монастыря повидали и поляков, и немцев, и стрелецкие отряды, и шайки разбойников. 21 августа 1612 года на Девичьем поле произошло решающее сражение, где русское ополчение встретилось с поляками. Именно отсюда Дмитрий Пожарский повел потом к Кремлю победоносные русские дружины. В это время для царственных особ обитель по-прежнему была убежищем. В 1610–1611 годах в его стенах пребывала дочь Бориса Годунова, царевна Ксения Годунова (в монашестве Ольга), постриженная по повелению Лжедмитрия. Вместе с ней в обители находилась ливонская царица Мария (в инокинях Марфа), дочь князя Владимира Старицкого, двоюродного брата Грозного, которую привезли из Риги еще в начале 80-х годов XVI века и считали ближайшей престолонаследницей. В 1615 году в стенах монастыря поселилась царица Мария Петровна Буйносова-Ростовская (в монашестве Елена), вдова свергнутого в 1610 году с престола царя Василия IV Шуйского.

Усердием первых представителей династии Романовых – царей Михаила, Алексия и Феодора – в середине XVII века монастырь был полностью восстановлен, наделен вотчинами и абсолютно освобожден от податей в казну. Патриарх Никон, когда в 1656 году показывал обитель антиохийскому патриарху, заметил, что во всей России не найдется монастыря богаче, чем этот. Периодом наибольшего расцвета стали для Новодевичьей обители годы правления царевны Софьи Алексеевны (1682–1689). Именно при Софье сложился уникальный, не похожий ни на какой другой архитектурный ансамбль, который и по сию пору изумляет гармонией пропорций, восхищает разнообразием форм и изысканностью убранства.

По повелению царевны стены обители были значительно укреплены, расширены и украшены зубцами, а двенадцать сторожевых башен увенчались изящными декоративными навершиями в виде корон. Четыре угловые башни были круглыми: Напрудная, Никольская, Чеботарная, Сетуньская, а остальные восемь – четырехугольными: Лопухинская, Царицынская, Иоасафовская, Швальная, Покровская, Предтеченская, Затрапезная и Саввинская.

Над северными и южными вратами выросли церкви Преображения Господня и Покрова Божией Матери с прилегающими к ним парадными постройками дворцового типа. Эти двух– и трехэтажные постройки предназначались для царевен Екатерины и Марии. Вдоль северной стены были построены просторные каменные кельи для монахинь-«крылошанок», которые получили название Певческого корпуса. Пятиярусный иконостас Смоленского собора был украшен роскошной сквозной резьбой с позолотой. Эта потрясающая резьба была выполнена мастерами Оружейной палаты.

Наряду с надвратными храмами была сооружена обширная трапезная палата с Успенской церковью (1685–1687), на ее втором этаже располагался небольшой храм Сошествия Святого Духа. В последний год правления Софьи была построена семидесятидвухметровая колокольня. Она стала главной композиционной вертикалью архитектурного ансамбля монастыря. В основании колокольни находилась Иоасафовская церковь, которая соединялась с покоями царевны Евдокии Алексеевны, на втором этаже располагался придел святого апостола Иоанна Богослова, на третьем и пятом ярусах – звонницы.

После семилетнего регентства и произошедшего в 1698 году стрелецкого бунта царевна Софья была заключена в Новодевичью обитель, превратившись из ктитора в узницу. Впрочем, и в стенах обители она казалась своему венценосному брату опасной, и вскоре Софью обвинили в организации нового заговора. После этого в монастырь попали еще две ее сестры: царевны Евдокия и Екатерина. Сама же Софья по приказу Петра была пострижена в монашество с именем Сусанна. Ее поместили в стрелецкую караульню у Напрудной башни под строгий надзор. Вместе с Софьей в опалу попала и ее любимая обитель. В 1704 году царевна скончалась, а за год до этого она приняла постриг в схиму со своим прежним именем София. После ее обитель еще около двадцати пяти лет стояла закрытой под охраной солдат-преображенцев.

В 1727 году в монастыре поселилась царица-инокиня Елена, в миру – Евдокия Федоровна Лопухина, первая жена Петра I, которую по его повелению постригли еще в 1699 году и содержали сначала в Суздальском Покровском монастыре, а с 1725 года – в Шлиссельбургской крепости. Лопухина тихо преставилась в 1731 году и была похоронена в южном нефе Смоленского собора. Здесь же расположены гробницы опальных царевен Софии, Евдокии и Екатерины.