Чтобы упрочить положение вновь создаваемой обители, А. И. Ходкевич и епископ Смоленский Иосиф Солтан записали в ее пользу земельные угодья в различных местах Гродненской губернии, дававшие монастырю ежегодно 30 000 рублей дохода. По уставу, данному Супрасльскому монастырю его основателями, обитель эта находилась в зависимости от Киевских митрополитов, которые, впрочем, без сношения с ктиторами Ходкевичами не могли вмешиваться в ее внутренние дела. Архимандрит избирался из числа братии и посвящался в сан митрополитом с ведома и согласия Ходкевичей.

На протяжении XVI в. число братии в монастыре колебалось от 70 до 100 человек. Многие из них прославились высокими иноческими подвигами; было среди них и несколько отшельников, которые жили в особом скиту. Подвизались в обители и ученые иноки, которые собирали книжные редкости, в результате чего в монастыре составилась обширная библиотека – главным образом, из святоотеческих писаний на разных языках (славянском, греческом, латинском и польском). Некоторые из ученых иноков оставили и собственные сочинения, написанные в XVI–XVII вв. и направленные на обличение заблуждений латинян и иудеев.

Значение Супрасльского монастыря было очень велико, и его стены видели не только простых богомольцев, но и многих бояр, князей и даже некоторых коронованных особ. Так, в 1543 г. обитель посетил король Польский и великий князь Литовский Сигизмунд Казимирович, который приезжал (как сказано в монастырской летописи), «чтобы видеть церковь и местность и слышать молебное пение. Он был на богослужении, которое выслушал от начала до конца, входил в алтарь, осматривал кресты и евангелия. По обозрении церкви ходил по монастырю, был в трапезе; затем, по раздаче милостыни убогим, отбыл из монастыря в умилении».

При введении в Западной русской церкви унии настоятель Супрасльского монастыря архимандрит Илларион, присутствовавший в числе других православных владык на Брестском соборе 1596 г., написал осуждение на принявших унию. А в 1601 г. вместе с братией он провозгласил в церкви анафему на Киевского митрополита Ипатия Потея, принявшего унию, за что был осужден королевским указом на изгнание. Через 2 года иеромонах Герасим Великонтий, избранный в настоятели Супрасльского монастыря, дал обязательство быть в единстве с римской церковью. Но нравственные силы обители были так велики, а дух православного иночества настолько живуч, что, внешне состоя в унии, монастырь еще почти целое столетие сохранял все признаки веры истинной и славной. Униатский митрополит Киприан Жоховский в конце XVII в. приказал было своему наместнику стричь братии волосы и брить бороды, но иноки восстали против этого и пожаловались римскому папе за принуждение «совершать обряды по двум вероисповеданиям».

После введения унии и совращения ктиторов Ходкевичей в католичество монастырь (к тому времени уже имевший статус лавры), несмотря на свои большие средства, стал быстро приходить в упадок. Благочестие среди иноков убывало, число братии уменьшалось, и Киевский митрополит Петр Могила в письме к ректору Киевской духовной академии Кассиану Сасовичу (отступнику от веры православной) писал о монастыре:

«А ныне до чего он доведен? Где прежде, под управлением православных, было до ста или, по крайней мере, до семидесяти человек братии, там ныне живет едва несколько монахов. И что еще хуже – мирской господин обладает церковным богатством и селами и через своих рабов выделяет инокам жалованье, как захочет. Спроси только в том монастыре кого-нибудь, где те древние иконы, которые украшены были серебряными и позлащенными ризами? И узнаешь, что они обращены униатами на свои надобности; вместо же серебряных икон поставлены в церковь полотняные итальянские. Хорошо меняются с Богом: Ему – полотно писанное, а себе – серебро вызолоченое!».

Когда архимандритом Супрасльского монастыря стал Полоцкий архиепископ Гавриил Коленда, тот избрал монастырь своей резиденцией и часто устраивал в нем пиры для гостей. И обитель пришла в такую бедность, что часто не хватало вина для богослужений, а монахи не имели даже ряс и ходили в одних плащах, проделав в них дыры для рук. Когда же братия вынуждена была доложить обо всем архимандриту, тот пришел в такой гнев, что, уезжая в Полоцк, так «благословил» обитель: «Погодите, дождусь я того, что на этом месте будут жить и петь только воробьи».

Долго еще продолжались бедствия монастыря, но были у него и счастливые времена. Так, в конце XVII в. в обители открыли типографию, в которой печатались богослужебные книги на славянском языке. При типографии была и своя бумажная фабрика.

Супрасльские иноки даже в униатский период оставили по себе добрую память, переходящую из века в век. Многие при вступлении в монастырь вносили значительные пожертвования: так, алтарь соборного храма был расписан и украшен лепниной на вклад одного монаха. А расписывал его иеромонах Антонин Грушецкий – бывший живописцем при королевском дворе.

В 1807 г. Белостокский край был присоединен к Российской империи, но правительство Пруссии, под властью которой он находился долгое время, успело отобрать у монастыря все его имения. У обители оставалось только то, что находилось в ее ограде. Взамен имений монастырю было назначено пособие в размере 2220 талеров в год и 75 сажен дров. Монастырь пытался вернуть себе хотя бы часть отобранных имений, но безуспешно. Через несколько десятилетий из государственной казны монастырю выделили 92 десятины земли и 23 десятины сенокосов по реке Супрасль. Через 20 лет было отведено еще 150 десятин лесу вместо дров, до того отпускавшихся натурой.

В 1839 г. Супрасльский монастырь воссоединился с Православной церковью, в 1865 г. в его стенах расположилось духовное училище, которое находилось на содержании монастыря (кроме жалованья учителю). С сокращением монастырских средств сократился и состав братии, поэтому большая часть монастырских зданий была занята под госпиталь. Военное ведомство зданий не ремонтировало, и они постепенно приходили почти в полную негодность. Из-за этого монастырь вынужден был отдать много своих зданий в аренду под суконную фабрику немцу Захерту. Одновременно тот взял в аренду и монастырский фольварк с условием владения на все время, пока будет платить за аренду 450 рублей в год. А в отданных зданиях располагались монастырская библиотека, трапеза, кухня с кладовыми, помещение бывшей типографии, переплетная мастерская! Но так как условия контракта были невыгодными, в 1883 г. все отданные в аренду здания были проданы за более высокую цену – тому же Захерту…

Все каменные здания монастыря построены в XVIII в., но пожар 1895 г. уничтожил крыши на братских корпусах. После этой катастрофы над средним одноэтажным корпусом был надстроен второй этаж, потом построили новую трапезу с кухней, баню, прачечную и каменную ограду.

К концу XIX в. в монастыре существовала каменная однопрестольная церковь во имя Благовещения Пресвятой Богородицы. Первоначально в ней были устроены два придела: один – в честь святых мучеников Бориса и Глеба, другой – в честь преподобных отцов Печерских Антония и Феодосия. С введением унии приделы эти были уничтожены; вместо них устроили по образцу римских алтари, поставленные при двух колоннах, поддерживающих средний купол храма. Алтарная живопись еще в конце XVIII в. была изменена в итальянском стиле, а нижняя часть стен внутри церкви по окна была заделана досками. Верхнюю часть и все остальное пространство из-за обветшавшей живописи забелили известью. Когда в 1887 г. известь сняли и изображения промыли водой, церковная живопись отчасти вернула себе первоначальный вид.