«Фонд Найтингейл» позволил ей не ограничиться созданием научных и научно-популярных работ по санитарии, а перейти к практической деятельности — созданию первой в Англии Школы сестер милосердия. Она была открыта на базе госпиталя святого Фомы близ Лондонского моста через шесть месяцев после выхода в свет «Заметок по уходу за больными». Руководителем Школы стала Сара Уордропер, старшая сестра госпиталя святого Фомы. Именно ее в свое время Найтингейл попросила отобрать сестер милосердия для работы в госпиталях во время Крымской войны.

Школа сестер милосердия Найтингейл закрылась лишь в 1996 году — после 136 лет успешной деятельности.

В июле 1860 года было отобрано 15 слушательниц, которым предстояло в течение года пройти курс подготовки. Все расходы по их обеспечению на время обучения взял на себя «Фонд Найтингейл». Обучение включало в себя не только учебный курс, но и наставления относительно поведения и внешнего вида сестры милосердия. Учеба была тяжелой, но студентки, желая оправдать ожидания Найтингейл, не жаловались.

Подкосило ее другое трагическое событие. Сразу после окончания Крымской войны Сидни Герберт начал страдать от неизлечимой болезни почек, и ему требовался полный покой. Однако Найтингейл возлагала на него большие надежды в борьбе за санитарную реформу, и Герберт по мере сил продолжал трудиться на посту военного министра и председателя Королевской военно-медицинской комиссии. Тяжелая болезнь заставила его покинуть пост члена парламента и оставить за собой только службу в военном ведомстве. Найтингейл глубоко уважала Герберта и ценила то, что он, несмотря на плохое состояние здоровья, продолжал работать. Однако 2 августа 1861 года Герберт скончался.

Найтингейл, узнав о его смерти, впала в глубокое отчаяние. Она не просто потеряла одного из самых близких друзей, но утратила нити, связывавшие ее с военным ведомством. Иными словами, теперь ее деятельность по реформированию военной медицины неизбежно должна была столкнуться с целым рядом проблем. Впрочем, Флоренс интересовало здоровье не только солдат. Борясь со своей болезнью, она считала, что здоровье является краеугольным камнем счастья для любого человека. Для нее подобные взгляды были тем более актуальны, что к началу 1860-х Найтингейл не могла передвигаться и с той поры почти не выходила из своей комнаты.

В 1864 году, когда Найтингейл работала, уже не вставая с постели, к ней обратился за советом бизнесмен Уильям Рэтбоун — этот богатый филантроп оказывал помощь больным беднякам, посылая к ним приходящих сиделок. На этот раз он обратился к ней с просьбой подобрать штат сестер милосердия для работы в ливерпульской лечебнице при работном доме. Школа сестер милосердия пользовалась хорошей репутацией, и спрос на ее выпускниц был очень высоким. Работные дома появились в Великобритании, чтобы дать средства к существованию тем беднякам, которые не могли самостоятельно заработать на жизнь — в этих домах они и работали, и жили. Многие из них являлись инвалидами или психически больными людьми. Там же содержались дети-сироты и дети, брошенные родителями.

Найтингейл без проволочек приступила к делу и после оформления необходимых документов послала в лечебницу при ливерпульском работном доме группу сестер милосердия. Она состояла из 12 выпускниц ее Школы во главе с Агнессой Джонс, любимой ученицей Найтингейл. Благодаря умелой работе этих квалифицированных сестер милосердия уровень ухода за больными в ливерпульском работном доме значительно возрос.

Эксперимент завершился успехом, и Найтингейл решила развернуть реформистское движение в более широком масштабе. На этот раз местом проведения больничных реформ должен был стать Лондон.

В конце 1864 года Найтингейл начала деятельность, направленную на реформирование медицинского обслуживания бедняков. Сдвинуть дело с мертвой точки было крайне трудно, но общественная деятельница вкладывала все силы в составление отчетов, выражающих ее точку зрения. Она считала, что реформы должны быть направлены не на «наблюдение» над бедняками или больными, но на то, чтобы помочь им жить полноценно. Ее усилия не пропали даром — в 1867 году был принят акт о реформе здравоохранения, заметно облегчивший положение бедноты.

Параллельно Флоренс участвовала в дискуссиях о плохих санитарных условиях в Индии, крупнейшей британской колонии. Как показали статистические данные, большая часть служивших там британских солдат погибала не от ран, а от различных болезней. После восстания сипаев, подавленного в 1859 году, Найтингейл всерьез задумалась над улучшением медицинского обслуживания британских солдат в Индии. Однако все ее обращения в правительство оставались без ответа, и тогда она написала книгу «Наблюдения», намечавшую путь санитарной реформы в Индии. Это богато иллюстрированное издание предназначалось для широкой публики. Министерство торговли и промышленности отказалось финансировать столь дорогую книгу, так что Найтингейл пришлось из своих средств оплатить работу иллюстраторов и типографские расходы. Книга вышла большим тиражом и была разослана влиятельным общественным деятелям страны. Создав таким образом благоприятный фон, Найтингейл выпустила огромный двухтомный труд «Отчет индийской санитарной комиссии». Это исследование произвело большое впечатление: его часто цитировали в средствах массовой информации, благодаря чему широкая публика узнала о существовавших в Индии санитарных проблемах.

Титаническая работа привела к тому, что Найтингейл начала слабеть и перестала себя полностью контролировать эмоционально. К счастью, Джоуэтт, близкий друг Найтингейл, увидев ее критическое состояние, написал об этом ее матери. Флоренс смогла забыть все недоразумения и прийти в себя среди родных, проведя три месяца в поместье Ли Херст. Впоследствии, когда позволяла работа, она не раз еще приезжала туда. Проведенное в родительском доме время наполнило Найтингейл ощущением покоя и счастья, однако это не означало, что ее здоровье совсем поправилось.

Найтингейл получала много писем. Ее посещали сотни посетителей из разных стран, ее совета спрашивали женщины, желавшие стать сестрами милосердия. После 1868 года, когда премьер-министром стал Уильям Гладстон, ее общественная активность существенно снизилась.

Однако она не собиралась полностью уйти на покой. Ее друг Бенджамин Джоуэтт советовал ей сосредоточить свои усилия на литературном поприще. Следуя его совету, она написала три работы по теологии. Две из них были опубликованы в журнале и произвели сильное впечатление на читателей. Найтингейл принимала участие в редактировании книги Джоуэтта «Платон», а также помогала ему в подготовке книги «Библия для детей и школьников».

В начале 1874 года Найтингейл потеряла своего отца, которому было тогда 80 лет. Он умер внезапно, упав прямо на лестнице в своем доме. Через несколько недель Найтингейл получила еще одну печальную весть — умерла миссис Брейсбридж, подруга ее юности, на полтора года пережившая своего мужа. Найтингейл писала: «Мистер и миссис Брейсбридж были людьми, которые сформировали мою жизнь». После смерти отца возник ряд проблем с его завещанием, но усилиями дочери мать смогла остаться в поместье Ли Херст.

Последующие шесть лет Флоренс ухаживала за своей ослепшей матерью. В эти годы она чувствовала себя очень одинокой и записала в дневнике: «Самым трудным в моей жизни были не годы Крымской войны и не период, когда я работала по 22 часа в сутки, а эти 5 лет и 8 месяцев после смерти отца». В 1880 году, когда Найтингейл исполнилось 60 лет, умерла ее мать, через 10 лет — сестра.