Разрядная книга называет имена трех наместников, получивших назначение «на береженье» князя Юрия: бояр И. А. Куракина, Д. С. Шестунова и А. И. Прозоровского (дворецким), поэтому вполне вероятно, что под их управлением находились три разрозненных землевладения: московское подворье, Угличский и Дмитровский уделы. Выделение удела князю Юрию Васильевичу свидетельствует о внесении изменений в духовную грамоту государя по смерти царицы Анастасии. Несомненно, поправки в завещании отражали полную «остуду» царя к княгине Старицкой, но опале подверглись ее сторонники. Иван IV «положил свой гнев» на попа Сильвестра, обвинив в «чародействе» и упрекая в том, что «от него пострадах душевне и телесне». Фактически тот был обвинен в отравлении царицы и детей, а также в попытке убийства самого царя. В Москве был созван собор, который вынес заочный смертный приговор Сильвестру и его сподвижнику Адашеву, но оба избежали казни. Адашев был сослан в Дерпт, где скончался от «огненной болезни». В ближайшем окружении царя его смерть объявили самоубийством, будто он «сам себе задал яд смертоносный и умре». Умертвить Сильвестра побоялись, тот скончался в заточении несколько лет спустя.

Через неделю после порохон царицы Анастасии был поднят вопрос о повторной женитьбе государя. Не прошло и сороковин, как сваты были направлены в Литву, Швецию и в Черкесию. Год спустя, в августе 1561 г., князь Старицкий присутствовал на венчании Ивана IV с Марией Темрюковной. Свадебные торжества проходили при закрытых дверях. Как отметил английский путешественник Дженкинсон, городовые ворота были заперты три дня, и никто «не смел выходить из своего дома (за исключением некоторых из его приближенных) во время празднования свадьбы; причина этого распоряжения неизвестна и доселе».

Видимо, уже во время свадьбы с Марией Темрюковной были введены должности «дружек», выполнявших совершенно новые функции. Их перечень находим в свадебной росписи 1572 г. (венчание с Марфой Собакиной): часовые на лестницах во дворце, на кремлевских и городских воротах, поставленные для того, чтобы «Государя Царя и Великого князя дворец от огня беречи и на двор не пущати ‹…› и ворота городовые пойтить запереть». Государь, несомненно, получил известие, что в «светлице» его тетки вышита третья плащаница «Положение во гроб. Оплакивание».

Царица Мария родила сына в июне 1562 г. Мальчика окрестили Василием. Около этого года в «светлице» княгини Ефросиньи мастерицы изготовили удивительный по красоте покров на раку Василия Кесарийского (память 1 и 30 января), вклад в Соловецкий монастырь. Исследователи отмечают необычность выбора сюжета из Жития: о «евреине Иосифе», который, «изяществуя в хитрости врачевательного художества», предсказал смертный час святому Василию, однако тот, к изумлению Иосифа, встал со смертного одра, совершил литургию и лишь после этого скончался.

Царевич Василий прожил меньше года, он умер 6 мая 1563 г., а в июне по доносу Саблука Иванова, дьяка князя Владимира, начался сыск по делу княгини Ефросиньи и ее сына по обвинению в злом умысле против царской семьи. Митрополит Макарий с духовенством просили простить Старицких. Князь Владимир получил прощение, но весь его двор был заменен новыми людьми по выбору государя. Его удельные права были урезаны. Царь возложил опалу на княгиню Ефросинью: 5 августа она приняла постриг под именем Евдокии и избрала местом своего пребывания Горицкий монастырь.

Старицкие потеряли многие привилегии, но сохранили жизнь, в то время как жестокие казни по приказанию царя приобретали все более угрожающий размах. Убийство князя Д. Ф. Овчины-Оболенского, совершенное царскими псарями весной 1564 г., ужаснуло ближайшее окружение государя. Митрополит Афанасий с боярами посетили Ивана IV и, грозя Божьей карой до третьего колена, увещевали его «не свирепствовать против людей».

Очевидно, в это же время тяжело заболел царевич Иван. Государь был вынужден снять опалу с князя Владимира и обратиться с молитвой к чудотворным веригам Никиты Столпника в совместной молитве. «Маия в 7 день царь и великий князь Иван Васильевичь всеа Русии ездил с Москвы в Переявлавль-Залесъской и со царицею своею великою княгинею Мариею и с сыном своим со царевичем Иваном в Никитцкой монастырь милитися к Никите Чюдотворцу и церковь камену в Никитцском монастыре во имя великомученика Христова Никиты свящати; да со царем же и великим князем был князь Володимер Ондреевичь». В последующие полгода казни утихают, а князь Владимир принимает участие в государственных делах и военных советах.

По свидетельству Шлихтинга, в это время Иван IV готовился к лицедейству с отречением от престола, с пострижением в монашеский сан и передачей власти своим несовершеннолетним сыновьям: «Он притворился, будто тяготится своим владычеством, хочет сложить государеву власть, жить в отдалении и уединении, вести жизнь святую и монашескую. Поэтому, позвав к себе знатнейших вельмож, он излагает им, что замыслил сделать, показал им двух сыновей и назвал их правителями державы».

Опираясь на сообщение летописи о пребывании «тогда» на Москве представителей высшего духовенства, исследователи высказали догадку, что в конце ноября — начале декабря 1564 г. в Москве «проходили заседания церковно-государственного собора», на котором решался вопрос добровольного или принудительного отказа Ивана IV от престола. В случае отречения неизбежно возникал вопрос о регентстве, т. к. царевичу Ивану исполнилось десять лет, а царевичу Федору — семь. При недееспособном князе Юрии наиболее вероятной кандидатурой на роль опекуна являлся князь Владимир Старицкий. Смерть князя Юрия Васильевича, скоропостижно скончавшегося 24 ноября 1564 г., вообще не оставила выбора. В случае смерти царевичей князь Владимир становился единственным правомочным наследником престола. Еще никогда Старицкие не были так близки к царским регалиям, как в исходе осени 1564 г.

Несомненно, к началу декабря на Соборе была достигнута предварительная договоренность о добровольном отречении царя и выработана процедура передачи власти регентскому совету. Видимо, предполагалось, что акт отречения состоится не в столице, а в Александровской слободе. Предстоящие события держали в тайне, чтобы избежать народных волнений.

Отъезд Ивана IV «на богомолье» проходил, по мнению современников, крайне необычным образом. Большой поезд включал царицу и царевичей; бояр, дворян и приказных людей с семьями; детей боярских со всем служебным нарядом. Государь также повелел взять с собой всю свою казну, платье, иконы и кресты. Однако, не доезжая до Слободы, по словам Таубе и Крузе, он отослал в Москву «многих подьячих и воевод, раздетых до нага и пешком и написал митрополиту и чинам следующее: “Он поедет туда, если Бог и погода ему помогут, им же, его изменникам, передает он свое царство, но может придти время, когда он снова потребует и возьмет его”».

Ровно месяц князь Старицкий, митрополит, архиепископы, архимандриты и бояре ожидали вестей от царя. Наконец, 3 января 1565 г. гонец привез грамоту, извещавшую об отречении Ивана IV. Вместо покаяния за жестокие казни царь указал иную причину для отречения — «измены бояр». По наблюдениям исследователей, дошедший до нас в летописном изложении текст грамоты содержит сведения о «боярских крамолах» двадцатилетней давности и не называет конкретных имен виновников, из чего сделан вывод, что «иск» государя был отредактирован при внесении в летопись. Возможно, в оригинале были перечислены обвинения в адрес княгини Ефросиньи и князя Владимира в наведении «лиха» с целью извести царскую семью и захватить престол. Его подозрения подтверждало известие, что мастерицы княгини Старицкой создали четвертый покров «Положение во гроб. Оплакивание».