В те годы Писарро и его военачальники уже завершали покорение Перу, и в 1534 году корона приняла решение разделить территорию Южной Америки, начиная от северных пределов вотчины Писарро до самого юга континента на четыре горизонтальных пояса от тихоокеанского побережья до Атлантики: первый был закреплен за Писарро, второй достался Альмагро, а третий получил представитель одного из самых известных аристократических кланов Испании и ветеран многих европейских войн Педро де Мендоса. Земли области Рио-де-Ла-Плата оказались в выделенной ему зоне, и он решил начать ее освоение с устья серебряной реки. Получив отказ в организации туда собственной новой экспедиции, Гарсия присоединился к флотилии Мендосы, но умер в ходе плавания, не увидев снова столь привлекавшей его Ла-Платы.

Педро де Мендоса был родственником вице-королей Мексики и Перу, сыном посла, братом другого посла, кардинала-архиепископа Севильи и связан семейными узами со многими важными сановниками и вельможами королевства. Он внес большой личный капитал во вверенное ему предприятие, что позволяло королю не нести в нем каких-либо собственных финансовых обязательств. Однако расходы на эту одну из самых крупных экспедиций в Новый Свет были столь обширны, что на их покрытие ее руководителю пришлось прибегнуть к значительным займам фламандских и немецких торгово-банковских домов Фуггерсов и Вельцеров, которые годами предоставляли займы королю Испании. Каждый из них предоставил для данной экспедиции свое собственное судно, полностью снабженное немцами, с полным снаряжением и немецкими экипажами. Один из их числа по имени Ульрих Шмидт стал неофициальным хроникером этого похода, оставив о нем очень подробные описания.

Все одиннадцать судов Мендосы с общей численностью около 2000 человек, включая женщин, сотней лошадей, десятками крупного рогатого скота, множеством свиней и другой нужной живности, а также с большим количеством разных предметов и инструментов для ведения хозяйства в поселении были собраны в Севилье. Мендосе, наделенному титулом аделантадо, было поручено завоевать и провести колонизацию земель Ла-Платы, обратить местное население в католичество и искать пролив из Атлантики в Тихий океан. Для облегчения быта поселенцев он получил разрешение на закупку 200 рабов во время остановки на островах Зеленого Мыса. Имя Мендосы привлекло большое число ни на что не способных авантюристов из благородных семей, как молодых людей, так и молодых особ, надеявшихся обрести богатство в приятном климате среди милых покладистых туземцев. Экспедиция вышла в плавание в августе 1534 года.

После пополнения запасов на Канарах и пятидневной остановки на Островах Зеленого Мыса эта внушительная армада направилась к берегам Бразилии, потратив два месяца на переход через Атлантику. Сначала они высадились на одном из островов около Баийи, а затем пробыли две недели в бухте Рио-де-Жанейро, где меланхоличный, больной, но резкий в своих действиях Мендоса лишь на основании непроверенных слухов об организации предполагаемого мятежа приказал казнить одного из испанских аристократов Осорио. 2 февраля 1536 года флотилия, пройдя устье Ла-Платы шириной свыше 70 лиг, вышла к берегу ее небольшого притока Риочуэло. Здесь аделантадо высадил несколько сот людей и более семидесяти выживших лошадей. Он дал этому месту длинное пышное название «Пуэрто-де-Санта-Мария-дель-Буэн-Айре», то есть «Порт Санта Марии Приятного Ветра», которое теперь известно как Буэнос-Айрес.

Поселенцы начали размещаться в наскоро построенных глинобитных хижинах, с покрытыми тростником крышами, так как в окружающей местности не было ни деревьев, ни строительного камня. Проживавшие на этой земле индейцы племени киранди первое время с готовностью делились с прибывшими своими скудными запасами рыбы и дичи, но затем они уже не могли оказывать помощь такому многочисленному поселению, а привезенные из Испании продукты уже давно подошли к концу или испортились. Есть становилось нечего, и Мендоса решил проучить индейцев за непослушание.

Он направил против них тридцать вооруженных всадников и триста пехотинцев во главе со своим братом Диего. Однако расчеты испанцев на легкую расправу с киранди оказались совершенно напрасными. Местные индейцы, привыкшие охотиться на крупных животных вроде гуанако, в отличие от своих сородичей в других землях континента не только совсем не боялись лошадей, но и знали, как их сваливать на землю, бросая на их ноги связанные веревкой каменные шары болеадорас. Кроме того они прекрасно стреляли из лука и были смелыми воинами. При встрече с напавшими на них испанцами они устроили им настоящий разгром, в ходе которого они убили самого Диего Мендосу и почти двести человек его отряда, уничтожили 20 лошадей, заставили оставшихся в живых скрыться от их преследования за стенами поселения и затем осадили его. В осажденной крепости Буэнос-Айрес свирепствовал голод, и людям пришлось съесть всех обнаруженных там мышей, крыс и змей, а затем даже прибегнуть к людоедству. В июне месяце киранди попытались взять форт, но осажденным удалось отбиться. Когда атаки прекратились, среди испанцев осталось всего 560 человек, а четыре парусника оказались сожженными в гавани. Буэнос-Айрес стоял на грани полной катастрофы.

Тем временем один из офицеров Мендосы Хуан де Айолас совершал плавание вверх по Паране, на которой он основал форт — поселение Корпус Кристи. Там к нему присоединился сам Мендоса, и их общая экспедиция составила четыре бригантины и четыре крупных лодки местного типа с общим числом в несколько сот человек. На месте разрушенного Санктис-Спиритус Кабот аделантадо заложил новое поселение Нуэсгра-Сеньора-де-Буэна-Эсперанса (Богоматерь Доброй Надежды), где оставленные им люди жили еще четыре года, занимаясь поисками золота и серебра. Сам Мендоса задержался в тех краях недолго. Страдая от нескольких болезней, он оставил экспедицию и вернулся в Буэнос-Айрес, подвергаясь в пути постоянным нападениям индейцев и потеряв более 30 человек.

Через некоторое время он послал двух своих офицеров на поиски Айоласа, но, сильно страдая от болезней и видя свою неспособность найти продовольствие для Буэнос-Айреса, в апреле 1537 года он отплыл в Испанию с двумя каравеллами, даже не дождавшись их возвращения. Перед отбытием он назначил Хуана де Айоласа генерал-капитаном Ла-Платы, оставив в будущей столице Аргентины 250 человек. Три месяца спустя на подступах к Азорским островам Педро Мендоса умер и был похоронен в море.

Сам Айолас, продолжая вверенную ему ранее миссию, поднялся по реке Парагвай на сотни миль выше впадения в нее Пилькомайо, то есть самой дальней точки, достигнутой Каботом. Там — это место было названо Канделярия — он наконец встретил индейцев, у которых действительно было много серебра, привезенного из шахт Перу, и которые проявили готовность его обменивать на испанские товары. В этих краях у местного населения было много продовольствия, поскольку эти небольшие, но многочисленные группы разных племен гуарани занимались не только охотой и рыбной ловлей, но и выращивали кукурузу, маниоку, картошку и другие культуры. Если индейцы отказывались давать продукты, испанцы жестоко их наказывали. На обратном пути вниз по реке на отряд Айоласа напали считавшиеся дружественными индейцы, и большинство его людей вместе с Айоласом были убиты. Эта трагичность ситуации усугубилась тем, что руководитель другой группы испанцев Доминго де Ирала, которому Айолас поручил встретиться с ним в Канделярии, ушел дальше по реке с бригантинами, не дождавшись своего командира. Таким способом Ирала хотел избавиться от Айоласа и взять на себя его полномочия, что ему в итоге и удалось.