Войска мамлюков появились перед Акрой 5 апреля 1291 г. и расположились вдоль всей линии обороны города. Войско из Хамы стало на севере напротив тамплиеров, в то время как слева от них войско из Дамаска противостояло госпитальерам. 6 апреля начался обстрел укреплений Акры из осадных машин. В ночь на 15 апреля и в последующие дни тамплиеры и госпитальеры сделали несколько неудачных вылазок. Новых попыток уже не было, а 4 мая с Кипра прибыл король с подкреплениями. Он попытался начать переговоры с султаном о мире, но в этом ему было категорически отказано. 8 мая было принято решение отвести людей с внешних стен, удерживать их уже не было никакой возможности. Защитники отошли на внутренние стены к 16 мая. В этот день мусульмане предприняли мощную атаку на ворота Святого Антония, и только совместные усилия тамплиеров и госпитальеров сорвали их попытку ворваться в город. В этом бою отличился своим мужеством Матье де Клермон. Два дня спустя мамлюки предприняли генеральное наступление на всем южном протяжении стен от ворот Святого Антония до Башни патриарха. Основной удар врага пришелся на выступ и отчасти на Проклятую башню, которая вскоре была взята. Тамплиеры и госпитальеры с Матье де Клермоном во главе объединились для контратаки, но были отбиты, а магистр ордена тамплиеров Гийом де Божё был смертельно ранен. Матье де Клермон вновь ринулся в бой.

Теперь мамлюки, пробивая себе путь вдоль стен, ворвались в город. Матье де Клермон погиб, сражаясь вблизи генуэзского квартала. Начался исход христиан. Толпы беженцев в небольших шлюпках пытались доплыть до галер, стоявших в море недалеко от города. Однако судов для эвакуации всего населения не хватало, и многие жители были жестоко убиты или взяты в плен. С наступлением ночи вся Акра была в руках аль-Ашрафа, за исключением большого дворца тамплиеров, расположенного на самой дальней оконечности мыса. Несколько дней спустя маршал тамплиеров Петр де Севрей согласился на перемирие, но издевательства арабских воинов над женщинами-христианками и их детьми, оказавшимися в плену, настолько разгневали защитников города, что они вырезали сарацин в пределах крепостных стен и приготовились сопротивляться до конца. На следующий день аль-Ашраф предложил им почетные условия сдачи, но, когда Петр и сопровождавшие его рыцари отправились на переговоры, они были схвачены и обезглавлены. Тем временем сарацины сделали протяженные подкопы под стены дворца, и они постепенно начали разрушаться. Когда 28 мая султан отдал приказ о штурме, ослабленная конструкция стен уже не могла вынести тяжести атаковавших, и стены рухнули и погребли под собой и мусульман, и христиан.

Магистр ордена госпитальеров Жан де Вилье был тяжело ранен во время боев за Акру. Когда город пал, сержанты и пажи отнесли его на корабль, отправлявшийся на Кипр. Позднее он писал с острова приору Сен-Жиля, что «охвачен он глубокой скорбью и пребывает в великой сердечной печали».

На Кипре многие беженцы из Сирии прозябали в нищете. Несмотря на то что орденские братья имели возможность получать в большом количестве продовольствие и предметы первой необходимости из Европы, они не уделяли этому должного внимания. Их моральный дух был подорван. История ордена Святого Иоанна с 1291 по 1310 г. условно делится на два периода. Первый продолжался до 1300 г. и характеризовался внутренним конфликтом и отсутствием цели. Однако второй период был отмечен судьбоносными событиями, которые привели к тому, что был заложен фундамент нового бытия ордена на Родосе.

Жан де Вилье и последние обитатели Конвента в Сирии перебрались на Кипр. В 1292 г. был созван Генеральный капитул, который постановил, что штаб-квартира ордена расположится в Лимасоле. Это решение утвердил папа Целестин V. В 1296 г. орден приступил к строительству в городе нового странноприимного дома для пилигримов. Это было само собой разумеющееся решение. Кипр был самым значимым государством Леванта, где еще сохранялась власть европейцев. На протяжении всего столетия его использовали как плацдарм для нападений на Египет и Сирию. Более того, госпитальеры владели несколькими большими имениями на острове, им принадлежали замок Колосси и недвижимость в Никосии и в самом Лимасоле.

Тем не менее у госпитальеров, как и у других латинских киприотов, отсутствовала конкретная цель в проводившихся тогда время от времени военных кампаниях. Газан, ильхан государства Хулагуидов, вторгся в Сирию в 1299 г. с большим войском, к которому присоединились отряды киликийских армян. Находясь на марше, вероятно где-то между Алеппо и Дамаском, он писал королю Кипра и магистрам госпитальеров и тамплиеров, приглашая их принять участие в экспедиции. В ноябре король Генрих имел встречу с Жаком де Моле, магистром ордена тамплиеров, и с Великим командором госпитальеров, который представлял отсутствовавшего Великого магистра ордена Гийома де Вилларе. Однако они не смогли согласовать единый план действий, хотя Газан уже вторично обратился к ним с посланием в конце месяца.

В 1300 г. состоялась вторая встреча. На этот раз к вышеупомянутым лицам присоединились посланник монголов и Амори Лузиньян, сеньор Тира и брат короля. Было принято решение собрать флот. 20 июля он отплыл из Фамагусты, взяв курс на Египет. Христиане достигли дельты Нила и, предав огню небольшое поселение, направились к Александрии. Они пробыли в порту один день, а затем поплыли на север. В окрестностях Акры и Тортосы они вступили в стычки с небольшими отрядами сарацин и разгромили их. Но когда госпитальеры на двух малых судах подошли к берегу и высадились в Мараклее, намереваясь раграбить город, они, вероятно, были настолько пьяны, что в результате внезапного нападения мусульман панически бежали. Галеры христиан стояли далеко в открытом море и не могли прийти им на помощь. Только после ожесточенного боя, в результате которого госпитальеры потеряли одного рыцаря и двадцать пеших воинов, они смогли пробиться к берегу.

В том же самом году другой гонец Газана прибыл на Кипр с известием, что ильхан снова намерен вторгнуться в Сирию и что он приглашает киприотов встретить его в Киликийской Армении. Амори собрал около 300 воинов, и еще столько же воинов или больше мобилизовали для него госпитальеры и тамплиеры. Гийом де Вилларе встал во главе госпитальеров и отплыл с этим небольшим войском на остров Руад, близ Тортосы, где был гарнизон тамплиеров. Амори захватил Тортосу, но несколько дней спустя отступил на Руад, потому что его союзники так и не подошли. Монголы появились в окрестностях города лишь в феврале следующего года, но вскоре отступили, опустошив Сирию вплоть до Хомса. Амори с войском вернулся на Кипр. Гийом де Вилларе совершил два похода в Киликийскую Армению между 1300 и 1305 гг.

Военные кампании, предпринимаемые без определенной цели, не были ни духоподъемными, ни конструктивными. Следует, однако, иметь в виду, что госпитальеры проводили реорганизацию военной структуры ордена. Вполне объяснимо, что после 1291 г. они старались меньше заниматься военными вопросами. Братьям не позволили уехать на Кипр. Статья устава от 1292 г. запрещала прием в орден рыцарей в большинстве европейских стран без санкции Великого магистра и Великого командора заморских территорий, что объяснялось отсутствием вакансий: в ордене и так уже было много братьев-воинов. После 1300 г. начали действовать правила, определявшие, какое число братьев могло проживать на Кипре. По-видимому, впоследствии были приняты еще большие ограничения. Госпитальеры сократили количество своих сухопутных частей и начали уделять большее внимание войне на море. Эта перемена в орденской политике глубоко отразилась на последующей истории госпитальеров. Вне всякого сомнения, это был естественный результат их нового островного существования. Однако новый курс, вероятно, не только получил поддержку, но и был инициирован папством. Уже в конце 1291 г. папа Николай IV поспособствовал скорейшему отплытию флота госпитальеров из Западной Европы. В 1292 г. он писал Жану де Вилье, что разрешает ему использовать галеры ордена для защиты Киликийской Армении; и он также упомянул, что приказал госпитальерам отстроить флот. Развитие военно-морских сил было стремительным. Король Неаполя Карл II сообщал о 10 галерах ордена на Кипре; а в 1297 г. папа Бонифаций упоминал об использовании братьями своего флота в войне с исламом. Сторонники реформ в ордене заявляли в 1295 г., что война должна вестись в равной мере как на суше, так и на море; и в 1299 г. появился первый адмирал-госпитальер. Папство стремилось к повышению эффективности военных операций флота госпитальеров, и в 1306 г. папа ходатайствовал за братьев перед королем Кипра, который запрещал им вооружать свои корабли без королевских лицензий, приобретение которых стоило больших денег.