Встретившись со своей невестой 30 января 1560 года уже на территории Испании, в Гвадалахаре, Филипп заявил, что «абсолютно счастлив». Елизавета вскоре написала матери, что, получив такого мужа, считает себя счастливейшей девушкой в мире. Несмотря на то, что юная дама могла радоваться теплому приему и доброте супруга, трудно себе представить, чтобы Филипп мог вызвать в невесте столь бурный энтузиазм. Суровый, сухой и педантичный, испанский король полагал своей главной задачей спасти мир от ереси. Для него не могла пройти незамеченной ни одна мельчайшая деталь. Спустя несколько лет Екатерина, вся жизнь которой была мучительным сочетанием материнских и династических проблем, сделалась для Филиппа непостижимой загадкой и камнем преткновения. Однако какое-то время — отчасти благодаря заслугам Елизаветы Испанской — отношения между двумя странами отличались небывалой теплотой. Филипп также сдержал слово, данное умирающему Генриху II, взять Францию под свою защиту. Испанский король был поражен, видя соседнее государство, наводненное еретиками, которые могли отравить и его королевство, и это сократило период сердечных отношений между странами.

В феврале 1516 года слухи о заговоре против Гизов и их режима начали просачиваться из Парижа в Блуа. Нараставшее количество протестантов и других враждебных администрации лиц обратились к Луи Конде, прося возглавить движение против Гизов. Они хотели захватить братьев, предать их суду и «освободить» короля, при этом присягнув ему на верность. Двадцатидевятилетний Конде, ставший протестантом через жену, Элеонору дю Руа, был низкорослым, но энергичным человеком, у него хватало и храбрости, и силы духа. Не имея возможности напрямую возглавить восстание, принц, подготовив все детали, доверился мелкому дворянину из Перигора, сеньеру де Ла Реноди. Ла Реноди, прежде клиент Гизов с сомнительным прошлым, вынужден был отправиться в Женеву, где принял кальвинизм. Кальвин лично не имел с ним дел, но ему оказывал поддержку Теодор де Без, старший из помощников Кальвина. После встречи 1 февраля 1560 года в Нанте, близ порта Гюг (Hugues), заговорщики согласовали свои цели, состоявшие в захвате Гизов и обращении с просьбой к королю, с тем, чтобы он разобрался с продажностью духовенства. После этого они полагали возможным исправить все прочие несообразности в королевстве, установив регентство Бурбонов. Ла Реноди разослал 500 агентов для сбора наемников, но так, чтобы имя организаторов держалось в секрете. В армию заговорщиков потянулись иностранные солдаты; обратились также за помощью к королеве Елизавете Английской. По одним источникам, королева дала какую-то сумму денег, по другим — обещала только моральную поддержку, но в любом случае толку было немного. Встречи заговорщиков в Гюге дали начало названию «huguenot» (в русском написании — «гугенот»), которым в дальнейшем обозначали французских протестантов. Они договорились начать восстание 10 марта, хотя впоследствии перенесли эту дату на 16-е.

К несчастью заговорщиков, слухи о восстании быстро распространились и эффект неожиданности не сработал. Шпионов и провокаторов в те дни развелось столько, что почти невозможно было сохранить такие вещи в тайне, какие бы меры предосторожности ни предпринимались. Кое-какие сведения просочились за пределы круга гугенотов и быстро распространились. Английские католики, прослышав о заговоре, предупредили кардинала Лотарингского, один из германских князей рассказал о готовящемся восстании архиепископу Аррасскому. В довершение всего сам Ла Реноди не смог удержаться и трезвонил на каждом шагу о своей роли в заговоре и о неизбежном падении его врагов. Он сообщил одному парижскому адвокату, сочувствовавшему гугенотам, у которого гостил, все подробности плана до последней детали. Тот, боясь, как бы его не обвинили в измене, передал информацию кардиналу. Убежденный в том, что за заговором стоит Елизавета Английская, раздосадованная участием Франции в шотландских делах, Франсуа де Гиз начал готовить операцию по подавлению восстания. Екатерина писала герцогине де Гиз: «Нас предостерегают отовсюду, вести идут в Блуа… король, мой сын, очень этим обеспокоен и приказал всем этим людям возвращаться по домам». Она продолжала соблюдать политику невмешательства, но Франсуа де Гиз вынашивал другие планы. Город Блуа было нетрудно взять штурмом, поэтому 21 февраля 1560 года герцог распорядился, чтобы король и двор незамедлительно переехали в соседний замок, в Амбуазе. Проникнуть за стены этой солидной средневековой твердыни заговорщикам было не так-то легко.

Екатерина спорила с Гизами, считая, что восстание вряд ли является английскими происками, но скорее всего, подогревается врагами режима в самой Франции. При поддержке Колиньи, побывавшего в плену и потому хорошо знающего обстановку, королева-мать настаивала на смягчении жестоких мер против протестантов, что могло бы предотвратить восстание. Потрясенный готовящимся бунтом и ростом непопулярности режима, Франсуа де Гиз утратил обычное хладнокровие. Прячась за стенами крепости, он отправлял отряды на поиски заговорщиков. Екатерина тем временем продолжала добиваться написания декларации для умиротворения гугенотов. Настоятельные попытки королевы-матери привели к изданию Амбуазского эдикта, обещавшего амнистию за все прошлые религиозные преступления тем, кто откажется участвовать в нынешнем восстании. Однако свободу вероисповедания эдикт не объявлял. Впрочем, в течение нескольких дней были освобождены некоторые узники, арестованные из-за их религиозных убеждений. Эти меры Екатерины позволили протестантам надеяться, что она станет обращаться с ними мягче, нежели лотарингские братья. Однако никто из них не смог изменить обстоятельства: отряды иностранных наемников уже были наготове, собираясь захватить замок.

В крепости ненадолго настало спокойствие. Придворная жизнь текла, как обычно, но между людьми то и дело пробегал шепоток. Между тем Ла Реноди, все еще уверенный в успехе своего мероприятия, был занят расстановкой войск у городка Амбуаза. Королевская семья и главные придворные ждали первого удара, надеясь, что их войска первыми обнаружат неприятеля. В напряженной обстановке, среди многих ложных тревог, просочился слух от иностранного информатора, что во главе восстания стоит некий «выскородный принц». Гадая, кто бы это мог быть, Екатерина назначила только что прибывшего Конде, чьи симпатии к протестантам ни для кого не были тайной, главой королевских телохранителей. Это заставило бы принца оставаться в замке при короле. Как ни почетно было это звание, оно, по сути, означало наложение домашнего ареста, ибо отлучиться Конде уже никуда не мог. Однако он сохранял видимость полного спокойствия.

6 марта в лесу близ Амбуаза была захвачена группа из пятнадцати человек. Они явно испытали облегчение, будучи пойманными, ибо участие в заговоре их сильно смущало. Один из офицеров гвардии пришел, королеве-матери и признался, что должен был участвовать в восстании — ему поручалось запереть на замок покои короля и разлучить его с Гизами. Кое-где находили другие разрозненные группы; выяснялось, что это простые люди, которым хотелось лишь поговорить с королем напрямую о новой религии. Наконец в ночь с 15 на 16 марта были пойманы главные лидеры восстания. Самого Ла Реноди обнаружили в лесу 19 марта. Он был застрелен выстрелом из аркебузы. Прослышав о провале мероприятия, многочисленные отряды повернули назад, а те, что все-таки дошли, были с легкостью рассеяны. Местные жители и посланные Гизами войска не только подавили любые проявления мятежа, но и поймали всех мятежников — одних убивали на месте, других отдавали под суд. Торжествующий герцог желал наказать заговорщиков так, дабы это стало уроком для всех в королевстве. Рядовых мятежников завязывали в мешки и топили в Луаре либо вешали на высоких местах — так, чтобы всем в городе было видно. Зубчатые стены и башни оказались очень удобными в качестве виселицы, и на протяжении десяти дней гроздья разлагающихся тел служили небывалым украшением замка. Факты не подтверждают распространенного мнения о кровожадности Екатерины: известно, что она пыталась спасти хотя бы одного офицера, но Гизы не обращали на нее внимания. Даже Анна д'Эсте, жена Франсуа де Гиза, пришла к королеве-матери и с плачем жаловалась на «жестокость и бесчеловечность» возмездия.