Финансовые затруднения ордена после конфискации в 1534 году его владений в Англии Генрихом VIII исключали возможность приобретения и оснащения новых военных кораблей. В результате к 1558 году орден располагал всего лишь четырьмя боеспособными галерами и одним галеотом. Эти суда три раза в год выходили в крейсерское плавание по открытому морю. В эти же годы вход в Большую мальтийскую гавань от форта Рикасолли до форта Сент-Эльмо был закрыт железной цепью.

Борьба рыцарей госпитальеров во главе с генералом орденских галер приором Пизанским Ботиджелой с пиратами принесла рыцарскому флоту европейскую славу.

Тогда уже в Уставе ордена появилось правило, что мальтийским рыцарем (так называли госпитальеров, после того как они переехали на остров Мальту) мог стать воин, участвовавший не менее трех лет в морских походах ордена.

В 1535 году флот госпитальеров совместно с испанскими кораблями совершил один из первых рейдов на алжирских пиратов Хайруддина Барбароссы. Начав поход из Сардинии и города Порто-Фарино, испанцы и рыцари-госпитальеры осадили и взяли турецкую крепость Гулетту — арсенал Барбароссы, освободив около 10 тыс. христианских пленников и захватив 300 пушек и 87 галер. Штурмом был взят и разграблен город Тунис, в котором рыцари не остались, а вернулись домой. В 1541 году бальи Георг Шиллинг возглавил четыре галеры ордена в экспедиции к берегам Алжира. В 1560 году пять галер ордена участвовали в новой неудачной попытке вернуть Триполи. Через три года галеры ордена вновь сражались рядом с испанским флотом. Перечисление боевых операций госпитальеров заняло бы много места, поскольку на протяжении XVI века рыцари неизменно участвовали во всех морских сражениях между Османской империей Сулеймана Великолепного и габсбургской Испанией Карла V и Филиппа II.

Но не всегда рейды госпитальеров заканчивались удачно, фортуна иногда изменяла им. Самая крупная неудача постигла госпитальеров в 1570 году, когда орден направил эскадру из четырех галер под командованием Жана Франсуа де Сент Клемента, годом ранее избранного главным капитаном орденских галер, на помощь венецианцам, защищавшим порт Фамагуста (Кипр), осажденный турками. 26 июня эскадра покинула Большую гавань и направилась в Палермо, который был назначен пунктом сбора. К несчастью, по дороге скончался капитан одной из галер — Сальваторе ля Батте. Сент Клемент, невзирая на протесты других капитанов, решил вернуться на Мальту, чтобы доложить о случившемся великому магистру дель Монте. Впоследствии, однако, выяснилось, что Сент Клемент взял в Сицилии на борт своей галеры груз продовольствия и вина для арагонского языка, в котором занимал пост консерваторе (интенданта). К тому же капитаны галер обвинили Сент Клемента в стремлении уклониться от боя со встреченными по дороге двадцатью галеотами знаменитого пирата Уджд Али, преемника Барбароссы и Драгута.

Морское сражение при Лепанто 1571 года. Гравюра на дереве Густава Доре.

В середине июля эскадра Сент Клемента вновь отправилась в плавание. Однако у берегов острова Гоцо, попав в сильный шторм, она стала легкой добычей поджидавших ее корсаров. Самому Сент Клементу удалось спастись, но более тысячи человек экипажа, включая 80 рыцарей, попали в плен. По возвращении на Мальту Сент Клемент был арестован, несмотря на рекомендательные письма, которыми он заручился в Риме. Орденский суд приговорил Сент Клемента и капитана одной из галер Орландо Магри к смертной казни с конфискацией имущества и исключением из ордена. Главным пунктом обвинения было то, что они оставили знамя ордена врагу. Решение суда получило на Мальте широчайший резонанс, поскольку Сент Клемента и Магри знали как отважных рыцарей, безупречно сражавшихся во время Великой осады. Воспоминание об этом печальном случае было свежо и 27 лет спустя, когда капитул ордена, собравшись на свое очередное заседание, постановил, что галеры, отправляющиеся на Корсо, не имеют права брать на борт никакого груза.

Через год судьба вновь свела госпитальеров и корсаров Уджд Али лицом к лицу, 7 октября 1571 года в заливе Лепанто был разгромлен и сожжен огромный турецкий флот, состоявший из 239 кораблей. Четыре галеры госпитальеров, предводительствуемые Пьетро Джустиниани, сражались на левом фланге. В результате неудачного маневра генуэзских парусников, увлекшихся преследованием отступавшего неприятеля, госпитальеры остались один на один с отрядом турецкого флота, сумевшим без потерь выйти из сражения. Он состоял из 30 галер под командованием Уджд Али. В завязавшемся неравном бою корсары захватили флагманскую галеру госпитальеров и зверски вырезали весь ее экипаж. Когда пришедшие на помощь союзники отбили орденскую галеру у корсаров, они нашли на ее борту всего трех оставшихся в живых рыцарей, включая чудом уцелевшего Джустиниани.

Справедливости ради надо сказать, что военные неудачи госпитальеров носили, как правило, частный характер. Из большинства столкновений с турками и североафриканскими корсарами они выходили победителями. В архивах ордена только за первую половину XVII века зарегистрировано 18 крупных морских побед и удачных десантов на территории Триполи, Туниса и Алжира. Примером может служить одна из наиболее выдающихся побед, одержанных рыцарями 5 мая 1603 года, когда флот рыцарей внезапно появился у западного побережья Пелопоннесского полуострова. Высаженный на берег десант легко захватил турецкие крепости в Лепанто и Патрасе. Турки потеряли около 400 солдат во главе с главнокомандующим, госпитальеры — только двух рыцарей и 10 солдат.

После сражения при Лепанто великие державы перестали собирать большие эскадры, требовавшие слишком больших инвестиций. К этому времени в Средиземном море создался определенный баланс сил, поддержанию которого немало способствовал орден госпитальеров. Однако победа над турками при Лепанто не уничтожила силу османов; в 1571 году турки захватили Кипр, в 1574 — Тунис, а в 1614 году небольшой отряд турок пытался высадиться на Мальте.

Госпитальеры продолжали вести агрессивные антитурецкие действия. Так, например, они в 1611 году атаковали Коринф в Греции и Керкенну на побережье Туниса. В 1645–1669 годах мальтийские рыцари помогали венецианцам защищать Крит.

После разгрома османов войсками Яна Собесского под стенами Вены в 1683 году начинается новый период средиземноморской истории. Он отмечен постепенным упадком могущества Османской империи, потерпевшей ряд чувствительных поражений в Эгейском и Средиземном морях. В ходе так называемой войны за Морею (1683–1699) госпитальеры действовали в тесном контакте с Антитурецкой лигой, объединившей на первом этапе Испанию, Польшу, Венецию и папское государство. Однако союзники действовали все более вяло. На смену средневековой романтике крестовых походов приходило трезвое стремление развивать торговые связи в восточном Средиземноморье. Герцогство Тосканское и Генуя первыми утратили интерес к войне. За ними последовала Венеция, получившая по Карловицкому миру (21 февраля 1699 года) Морею и часть Далматского побережья. В 1718 году турецкая война закончилась, а вместе с ней и крупные морские кампании в левантийских водах.